法洪文，孫 倩

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300073；2. 天津市人民醫(yī)院，天津 300121)

紅三葉聯(lián)合環(huán)磷酰胺對小鼠宮頸癌U14作用的實驗研究

法洪文1，孫 倩2

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300073；2. 天津市人民醫(yī)院，天津 300121)

目的觀察紅三葉聯(lián)合環(huán)磷酰胺對小鼠宮頸癌細(xì)胞系U14的作用。方法將U14瘤液接種在小鼠右前肢腋下，然后隨機分為對照組、環(huán)磷酰胺組、紅三葉低劑量組、紅三葉中劑量組、紅三葉高劑量組、紅三葉低劑量+環(huán)磷酰胺組、紅三葉中劑量+環(huán)磷酰胺組，對照組給予羧甲基纖維素鈉，其余組給予相應(yīng)藥物灌胃及腹腔注射給藥。給藥6d，每天觀察各組小鼠飲食、精神、活動情況及瘤體生長情況，第10天稱取小鼠體質(zhì)量，脫椎處死，取瘤塊稱質(zhì)量，計算抑瘤率及兩藥相互作用系數(shù)(CDI和Q值)，光鏡觀察腫瘤組織病理學(xué)改變，TUNEL方法檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果對照組小鼠腫瘤結(jié)節(jié)最明顯，生長速度也最快。紅三葉高劑量組、紅三葉低劑量+環(huán)磷酰胺組、紅三葉中劑量+環(huán)磷酰胺組對U14荷瘤小鼠的抑瘤率均達到了有效標(biāo)準(zhǔn)，同時單用紅三葉的藥物劑量不能小于400mg/kg。紅三葉促宮頸癌U14細(xì)胞的凋亡作用隨著藥物劑量的增加而明顯，紅三葉中劑量+環(huán)磷酰胺組促凋亡作用優(yōu)于環(huán)磷酰胺組，兩藥聯(lián)用具有協(xié)同作用。結(jié)論紅三葉對U14荷瘤小鼠有抑瘤作用，以紅三葉與環(huán)磷酰胺聯(lián)用效果最明顯，提示紅三葉與環(huán)磷酰胺聯(lián)用作為臨床治療宮頸癌的輔助藥物值得關(guān)注。

紅三葉；環(huán)磷酰胺；宮頸癌U14；抑瘤率；細(xì)胞凋亡

紅三葉為豆科多年生草本植物，含有多種異黃酮類物質(zhì), 這些異黃酮類物質(zhì)有著重要的生物作用[1]。近年來對紅三葉在抗腫瘤、抗氧化、提高機體免疫功能、防止前列腺增生、改善更年期綜合征以及防止骨質(zhì)疏松等方面的作用研究越來越受到關(guān)注[2]。宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，是造成婦女死亡的第三大常見原因。本研究觀察了紅三葉聯(lián)合環(huán)磷酰胺對小鼠宮頸癌細(xì)胞系U14的作用，旨在為宮頸癌的治療提出新的實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 實驗資料

1.1材料

1.1.1實驗動物 昆明種雌性小鼠70只，體質(zhì)量(20±2)g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，合格證號：scxk-(軍)2012-0004。天津市人民醫(yī)院清潔級動物飼養(yǎng)房飼養(yǎng)，溫度20～22 ℃，相對濕度45%～55%，自由飲水，用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.1.2瘤株 小鼠宮頸癌U14瘤株，天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所提供。

1.1.3藥物 紅三葉，購自西安小草公司，批號：XC20131009，純度為98%。注射用環(huán)磷酰胺，200 mg/支，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號：14021225。

1.1.4試劑 TUENL試劑盒，為德國寶靈曼公司原裝試劑盒。

1.2方法

1.2.1宮頸癌U14荷瘤小鼠模型的建立 將瘤株接種于昆明種小鼠，待生長7 d后出現(xiàn)腹水，在無菌條件下，用1 mL空針抽取腹水，加入生理鹽水，按1∶4比例(即1 mL腹水加4 mL生理鹽水)制成細(xì)胞懸液。取已稀釋好的U14細(xì)胞懸液0.2 mL，注射到小鼠右前肢腋下，每只注射0.2 mL，共接種70只小鼠，接種成功率100%。

1.2.2實驗分組及給藥 將接種瘤株成功的70只小鼠隨機分為對照組、環(huán)磷酰胺組、紅三葉低劑量組、紅三葉中劑量組、紅三葉高劑量組、紅三葉低劑量+環(huán)磷酰胺組、紅三葉中劑量+環(huán)磷酰胺組，每組10只。對照組給予羧甲基纖維素鈉0.4 mL/20 g灌胃，紅三葉低、中、高劑量分別按100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg(實驗之前已通過動物實驗證實此劑量安全[3])配置，0.4 mL/20 g灌胃，共給藥6 d。環(huán)磷酰胺僅接種24 h后腹腔給藥1次(60 mg/kg)。各給藥組按照上述相應(yīng)藥物劑量及方法聯(lián)合處理。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1荷瘤鼠習(xí)性及瘤體生長情況 觀察各組荷瘤鼠每天飲食、精神、活動情況，給藥前稱取荷瘤鼠體質(zhì)量，給藥后隔日測瘤鼠的體質(zhì)量，于接種后第5天開始隔日測量腫瘤體積，并做記錄。腫瘤體積按公式計算：瘤體積 = ab2π/6(a為腫瘤最長徑，b為最短徑)。

1.3.2抑瘤率 于接種后第10天稱取小鼠體質(zhì)量，脫椎處死小鼠，取瘤塊稱質(zhì)量，分別計算紅三葉各組和紅三葉聯(lián)合環(huán)磷酰胺各組的抑瘤率。抑瘤率(%)=(對照組平均瘤質(zhì)量-實驗組平均瘤質(zhì)量)/對照組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.3.3荷瘤鼠胸腺和脾臟指數(shù) 于接種后第10天，無菌方法解剖摘取小鼠胸腺和脾臟,用電子分析天平稱重,計算胸腺和脾臟指數(shù)。胸腺(脾)指數(shù)=胸腺(脾)質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%[4]。

1.3.4兩藥相互作用系數(shù)(CDI)及Q值 CDI=AB/A×B，其中AB為兩種藥物聯(lián)合組的平均瘤質(zhì)量與對照組平均瘤質(zhì)量的比值，A或B是兩種藥物單獨使用組的平均瘤質(zhì)量與對照組平均瘤質(zhì)量的比值；當(dāng)CDI<1時兩藥有協(xié)同作用，當(dāng)CDI<0.7時協(xié)同作用非常顯著。按照金氏公式計算Q值來判斷兩種藥物聯(lián)合效應(yīng)：Q=E(A+B)/[EA+(1-EA)×EB]，其中E(A+B)為兩種藥物聯(lián)合的抑瘤率，EA、EB為兩種藥物單用的抑瘤率；Q為0.85～1.15表示兩藥作用相加，Q>1.15表示兩藥作用協(xié)同，Q<0.85表示兩藥作用相互拮抗[5]。

1.3.5病理變化 于接種后第10天處死動物。各組均取2塊腫瘤組織分別置于10%中性甲醛溶液中固定,標(biāo)本經(jīng)乙醇梯度脫水，石蠟包埋，制作切片，再經(jīng)HE染色，以顯微鏡觀察及IDA-2000高清晰度數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)制出彩圖。

1.3.6細(xì)胞凋亡情況 在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察TUENL染色切片，每張切片隨機選取9個視野，計數(shù)每個視野內(nèi)的陽性細(xì)胞個數(shù)，結(jié)果以這9個視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)進行平均計算。陽性細(xì)胞的計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核染色呈棕黃色，大致為圓形或橢圓形，陽性細(xì)胞與周圍組織之間有少許的孔隙。計數(shù)結(jié)果為健康的腫瘤組織中陽性細(xì)胞數(shù)，壞死組織不計算在內(nèi)[6]。

2 結(jié) 果

2.1各組荷瘤鼠習(xí)性變化 接種后第1—3天，各組小鼠飲食、飲水、精神、活動方面無明顯改變。接種后第4天，可觸及各組小鼠右前肢腋下微小結(jié)節(jié)，各組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。第5天，對照組小鼠腫瘤結(jié)節(jié)明顯增大，且精神狀態(tài)欠佳，不活潑；環(huán)磷酰胺組、紅三葉聯(lián)合環(huán)磷酰胺各組較紅三葉各劑量組小鼠飲食、飲水、精神情況欠佳。第6—8天，各組小鼠的飲食、飲水均減少，精神萎靡，毛發(fā)無光澤，蜷臥，不喜活動，以對照組表現(xiàn)最明顯，且腫瘤結(jié)節(jié)最大，活動受限最明顯。實驗過程中各組各有1只小鼠死亡，可能與實驗操作有關(guān)。

2.2各組荷瘤鼠腫瘤體積比較 各組種植腫瘤的體積逐漸增大，且呈局部結(jié)節(jié)狀生長，以對照組小鼠腫瘤結(jié)節(jié)增大最明顯，速度也最快。第5天時，各給藥組瘤體體積均明顯小于對照組(P均<0.05)，紅三葉低劑量+環(huán)磷酰胺組、紅三葉中劑量+環(huán)磷酰胺組瘤體體積與環(huán)磷酰胺組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。第7天時，各給藥組瘤體體積均明顯小于對照組(P均<0.01)，紅三葉中劑量+環(huán)磷酰胺組瘤體體積明顯小于環(huán)磷酰胺組(P<0.05)。第9天時，各給藥組瘤體體積均明顯小于對照組(P均<0.01)，紅三葉低劑量+環(huán)磷酰胺組、紅三葉中劑量+環(huán)磷酰胺組瘤體體積均明顯小于環(huán)磷酰胺組(P均<0.05)。紅三葉對腫瘤體積的影響隨劑量的增加而增強。見表1。

表1 各組U14荷瘤鼠不同時間腫瘤體積比較

注：①與對照組比較，P<0.01；②與對照組比較，P<0.05；③與環(huán)磷酰胺組比較，P<0.05。

2.3各組荷瘤鼠瘤質(zhì)量及給藥各組抑瘤率比較 紅三葉低劑量組、紅三葉中劑量組瘤質(zhì)量與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；環(huán)磷酰胺組、紅三葉高劑量組、紅三葉低劑量+環(huán)磷酰胺組、紅三葉中劑量+環(huán)磷酰胺組瘤質(zhì)量均明顯低于對照組(P均<0.05)。紅三葉低劑量+環(huán)磷酰胺組、紅三葉中劑量+環(huán)磷酰胺組瘤質(zhì)量和抑瘤率明顯低于環(huán)磷酰胺組(P均<0.05)，紅三葉低劑量+環(huán)磷酰胺組、紅三葉中劑量+環(huán)磷酰胺組瘤質(zhì)量和抑瘤率明顯低于紅三葉高劑量組(P均<0.05)，紅三葉低劑量+環(huán)磷酰胺組瘤質(zhì)量和抑瘤率與紅三葉中劑量+環(huán)磷酰胺組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組U14荷瘤鼠瘤質(zhì)量及給藥各組抑瘤率比較

注：①與對照組比較，P<0.01；②與對照組比較，P<0.05；③與環(huán)磷酰胺組比較，P<0.05；④與紅三葉高劑量組比較，P<0.05。

2.4紅三葉與環(huán)磷酰胺聯(lián)合對U14荷瘤鼠腫瘤的作用 根據(jù)公式計算，紅三葉低劑量+環(huán)磷酰胺組Q=2.76，CDI=0.57；紅三葉中劑量+環(huán)磷酰胺組Q=2.09，CDI=0.61。提示紅三葉與環(huán)磷酰胺聯(lián)用具有非常顯著的協(xié)同作用，其中紅三葉低劑量+環(huán)磷酰胺組協(xié)同作用更顯著。

2.5各組荷瘤鼠胸腺、脾臟指數(shù)比較 紅三葉高劑量組胸腺指數(shù)與環(huán)磷酰胺組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其他各組胸腺指數(shù)與環(huán)磷酰胺組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，其中紅三葉高劑量組的胸腺指數(shù)最高。各組間脾臟指數(shù)相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，但隨著紅三葉劑量的增加，脾臟指數(shù)有隨之增加的趨勢。見表3。

表3 小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù) g)

注：①與環(huán)磷酰胺組比較，P<0.05。

2.6各組荷瘤鼠腫瘤病理形態(tài)學(xué)比較 肉眼觀察對照組腫瘤的體積最大，環(huán)磷酰胺組及聯(lián)合用藥組腫瘤體積明顯小于對照組，并可見有的荷瘤鼠在解剖時腫瘤已消失，以聯(lián)合用藥組明顯。光鏡下對照組腫瘤細(xì)胞密集分布，上皮全層極性消失，細(xì)胞顯著異型，核大，深染，染色質(zhì)分布不均，有核分裂相，見圖1。環(huán)磷酰胺組腫瘤組織中可見壞死瘤細(xì)胞，見圖2。紅三葉低劑量組瘤細(xì)胞密集，僅見少量壞死灶，有炎細(xì)胞浸潤，見圖3。紅三葉中劑量組可見瘤組織大量壞死，瘤塊面積縮小，見圖4。紅三葉高劑量組瘤組織中央大片壞死，見圖5。紅三葉低劑量+環(huán)磷酰胺組瘤組織呈大片壞死，瘤細(xì)胞分布不均，見圖6。紅三葉中劑量+環(huán)磷酰胺組腫瘤細(xì)胞壞死更明顯，周圍可見炎細(xì)胞浸潤，見圖7。

圖1 對照組瘤細(xì)胞病理形態(tài)(200×)

2.7TUENL細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果 對照組陽性細(xì)胞數(shù)目為(3.17±0.40)個/視野，環(huán)磷酰胺組為(17.83±1.14)個/視野，紅三葉低劑量組為(7.33±0.80)個/視野，紅三葉中劑量組為(7.83±2.60)個/視野，紅三葉高劑量組為(10.83±2.39)個/視野，紅三葉低劑量+環(huán)磷酰胺組為(21.17±2.36)個/視野，紅三葉中劑量+環(huán)磷酰胺組為(37.50±2.92)個/視野。各給藥組陽性細(xì)胞數(shù)均明顯多于對照組(P均<0.05)。紅三葉低劑量+環(huán)磷酰胺組陽性細(xì)胞數(shù)與環(huán)磷酰胺組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，紅三葉中劑量+環(huán)磷酰胺組陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于環(huán)磷酰胺組(P<0.01)。

圖2 環(huán)磷酰胺組瘤組織病理形態(tài)(200×)

圖3 紅三葉低劑量組瘤組織病理形態(tài)(200×)

圖4 紅三葉中劑量組瘤組織病理形態(tài)(200×)

圖5 紅三葉高劑量組瘤組織病理形態(tài)(200×)

圖6 紅三葉低劑量+環(huán)磷酰胺組瘤組織病理形態(tài)(200×)

圖7 紅三葉中劑量+環(huán)磷酰胺組瘤組織病理形態(tài)(200×)

3 討 論

本實驗采用動物移植性腫瘤的方法造模，優(yōu)點為實驗動物同時接種同量的腫瘤細(xì)胞，生長速率比較一致，個體差異小，接種成活率高，對宿主的影響類似，易于客觀判斷療效；實驗周期較短，實驗條件易于控制[7]。接種后第4天各組荷瘤鼠均可觸及右前肢腋下小結(jié)節(jié)，第5天對照組小鼠腫瘤結(jié)節(jié)比給藥各組明顯增大，說明模型的建立是成功的。

環(huán)磷酰胺作為抗腫瘤藥物已在臨床廣泛應(yīng)用，其對多種惡性腫瘤具有臨床效果，然而環(huán)磷酰胺也是一種強免疫抑制劑，能抑制細(xì)胞的增殖，對體液免疫和細(xì)胞免疫均有抑制作用，因此在治療腫瘤的同時也會帶來不良反應(yīng)[8]。紅三葉為豆科多年生草本植物，含有多種異黃酮類物質(zhì),是我國的特色天然藥物之一，故也稱紅三葉異黃酮[1],其抗腫瘤、抗氧化、提高機體免疫功能備受關(guān)注。筆者在本實驗前對紅三葉提取物最大耐受量的實驗中證明紅三葉安全無毒。

抑瘤率是衡量一種藥物抗腫瘤有效性的最基本和最重要的一個指標(biāo)，《現(xiàn)代腫瘤治療藥物學(xué)》關(guān)于抗腫瘤中草藥有效性的標(biāo)準(zhǔn)是抑瘤率>30%[9]。本實驗結(jié)果提示，紅三葉高劑量組、紅三葉低劑量+環(huán)磷酰胺組、紅三葉中劑量+環(huán)磷酰胺組U14荷瘤小鼠的平均瘤質(zhì)量均低于對照組，抑瘤率均達到有效標(biāo)準(zhǔn)，且紅三葉低劑量和紅三葉中劑量與環(huán)磷酰胺聯(lián)用時抑瘤率最佳，而紅三葉低劑量和中劑量組的抑瘤率均小于30%，所以單用紅三葉的藥物劑量不能小于400 mg/kg。從腫瘤生長體積變化上也可以看出，紅三葉低、中、高組隨著劑量的增加瘤體積逐漸呈減小趨勢，其中環(huán)磷酰胺組及聯(lián)合用藥組有的荷瘤鼠在解剖時腫瘤已消失，并以聯(lián)合用藥更明顯，說明環(huán)磷酰胺及聯(lián)合用藥對腫瘤生長的抑制作用更強。從計算的CDI及Q值可以看出，紅三葉與環(huán)磷酰胺聯(lián)用具有協(xié)同作用，并以紅三葉低劑量+環(huán)磷酰胺組協(xié)同作用更顯著，這一結(jié)果有待增加樣本量來進一步證實。

細(xì)胞凋亡的檢測可以從分子水平揭示藥物作用的機制。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種形式，是由細(xì)胞內(nèi)特定的基因操縱和調(diào)控的細(xì)胞自殺性行為[6]。細(xì)胞凋亡可防止因基因突變等因素引起的細(xì)胞大量增殖，在維持機體正常發(fā)育及組織穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用，并與腫瘤的發(fā)生和進程有密切關(guān)系。TUENL細(xì)胞凋亡檢測是檢測細(xì)胞凋亡敏感性和特異性較高的實驗。本實驗TUENL細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，各給藥組陽性細(xì)胞數(shù)均明顯多于對照組，紅三葉中劑量+環(huán)磷酰胺組陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于環(huán)磷酰胺組。表明紅三葉能誘導(dǎo)U14宮頸癌細(xì)胞株的凋亡，并隨著藥物劑量的增加而明顯，紅三葉中劑量聯(lián)合環(huán)磷酰胺的凋亡作用優(yōu)于單用環(huán)磷酰胺。通過計算荷瘤鼠胸腺和脾臟指數(shù)，同樣看出隨著紅三葉劑量的增加，胸腺和脾臟指數(shù)也隨著增加。但紅三葉能否增加機體免疫功能，減少環(huán)磷酰胺藥物劑量和不良反應(yīng)還有待進一步探討，紅三葉與環(huán)磷酰胺聯(lián)合作為臨床治療宮頸癌的輔助藥物值得關(guān)注。

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Experimental study of red clover associated with cytoxan on mice inoculated with cervical cancer cell(U14)

FA Hongwen1,SUN Qian2

(1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300073,China;2. The People’s Hospital of Tianjin,Tianjin 300121,China)

Objective It is to observe the inhibitory effect of red clover associated with cytoxan on mice inoculated with cervical cancer(U14). Methods The suspension of U14 was inoculated subcutaneously in right axillary of the mice, then they were divided randomly into 7 groups, namely cytoxan group(CTX), red clover of low dosage group(RCIL), red clover of mid dosage group(RCIM), red clover of high dosage group(RCIH), RCIL+ CTX group, RCIM + CTX group and control group. Control group was given Carboxymethylcellulose, and the other groups were given respective drugs by intragastric administration and intraperitoneal injection. All the mice were treated for 6 days, the diet, spirit, activity, and the size of tumor were observed everyday. On the 10th day, the body weight of the mice was measured and was put to death by drawing spinal card. The tumor weight was measured. The inhibitory rate of tumor of each group, the value of CDI and Q was calculated. The pathological changes were observed under microscope. The apoptosis was checked with TUNEL. Results In control group, the size of tumor was greatest,and the growth speed was the fastest.The RCIH group,RCIL+CTX group, RCIM + CTX group all had the inhibitory effect, achieved effective standard, and prompted us red clover only could not be less than 400 mg/kg.Red clover could induce apoptosis of U14, especially the drug measurement increasing. RCIM + CTX was better than the CTX, red clover combining with cytoxan had synergistic.Conclusion Red clover has obvious inhibitory effect in mice inoculated U14, and the combined test group is the most obvious, which indicate that RCIM combined with CTX should be noted for the assistant treatment of cervical cancer in clinic.

red clover; cytoxan; cervical cancer(U14); inhibitory rate of tumor; apoptosis.

法洪文，女，碩士，研究方向為中西醫(yī)結(jié)合治療婦科腫瘤。

孫倩，E-mail：zhangmm89@sina.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.29.003

R-332

A

1008-8849(2015)29-3199-05

2015-06-01