龍林梅

【摘 要】腫瘤的基礎(chǔ)研究一直是醫(yī)學(xué)類研究的熱點(diǎn)，研究者發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞具有高度侵襲和遷移的特性，對(duì)于侵襲和遷移特性的研究具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義，而實(shí)驗(yàn)技術(shù)是基礎(chǔ)研究中重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，本文針對(duì)研究腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的幾種常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)，提出相應(yīng)的改進(jìn)建議。

【關(guān)鍵詞】腫瘤；侵襲；遷移；實(shí)驗(yàn)技術(shù)

腫瘤的治療一直是生物醫(yī)學(xué)類研究很重要的一部分，惡性腫瘤成為威脅人類健康和生命的主要疾病之一，近些年來(lái)，我國(guó)及全世界的惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率都呈上升趨勢(shì)。近年來(lái)腫瘤相關(guān)研究取得了很大的進(jìn)展，但惡性腫瘤具有的高度侵襲和遷移特性成為腫瘤治療失敗的主要原因之一，因此腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移是抗腫瘤研究中的熱點(diǎn)。

1.檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的侵襲性和遷移性的常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)

基礎(chǔ)研究對(duì)臨床工作有著推動(dòng)作用，注重基礎(chǔ)研究不僅利于提高醫(yī)務(wù)工作者的素質(zhì)，并且利于開展交流合作，推動(dòng)行業(yè)發(fā)展，腫瘤疾病治療的研究工作最終還是要從基礎(chǔ)研究做起。實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)于基礎(chǔ)研究的發(fā)展有著至關(guān)重要的作用，實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)基礎(chǔ)研究的進(jìn)步。研究腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移特性時(shí)，常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)有Western blot、免疫組化、Transwell小室測(cè)定法、劃痕實(shí)驗(yàn)等，對(duì)這幾種實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行優(yōu)缺點(diǎn)分析能夠?yàn)榭蒲泄ぷ髡咛岢鼋ㄗh，讓科研工作者在研究過(guò)程中少走彎路，具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

1.1檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)蛋白

腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)蛋白有CD147、MMP-2、MMP-9、VEGF等。CD147是免疫球蛋白家族中一個(gè)高度糖基化的跨膜蛋白，能夠調(diào)控MMPs的表達(dá)，刺激MMP-2、MMP-9的產(chǎn)生，MMP-2、MMP-9能降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白成分，并且誘導(dǎo)VEGF的產(chǎn)生，促進(jìn)血管的生成，在惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。研究證實(shí)，這些蛋白的表達(dá)水平都與腫瘤細(xì)胞的惡性程度、腫瘤的侵襲和遷移有著密切的聯(lián)系，通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平，一定程度上可了解腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移特性。

在基礎(chǔ)研究中，通?？梢酝ㄟ^(guò)Western blot來(lái)檢測(cè)侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，從而確定腫瘤細(xì)胞的侵襲性和遷移性是否存在差異，這種方法一定程度上是可以讓研究者間接了解腫瘤細(xì)胞的侵襲性和遷移性的變化，并且Western blot的方法可以量化蛋白的表達(dá)水平，但缺點(diǎn)是檢測(cè)蛋白表達(dá)水平對(duì)于判斷侵襲性和遷移性不夠直觀，實(shí)驗(yàn)步驟較為復(fù)雜，抗體和蛋白的親和力存在差異，并且抗體價(jià)格相對(duì)比較昂貴，因此此方法存在一定的局限性。

1.2Transwell小室測(cè)定法

Transwell小室測(cè)定法可用于測(cè)定腫瘤細(xì)胞的侵襲性和遷移性，Transwell小室底部有一張通透性膜。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)，分別在小室內(nèi)、外加入不同的培養(yǎng)液，將腫瘤細(xì)胞接種在小室內(nèi)，細(xì)胞對(duì)小室外的培養(yǎng)液有趨化性，一段時(shí)間之后，侵襲性和遷移性較高的腫瘤細(xì)胞可從小室內(nèi)遷移到小室外，終止培養(yǎng)，將小室內(nèi)膜上的細(xì)胞擦拭干凈，置于鏡下觀察，可看到遷移到小室外膜上的腫瘤細(xì)胞，從而研究腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移特性。Transwell小室測(cè)定法研究侵襲和遷移更加的直觀，實(shí)驗(yàn)步驟較簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)是只能半量化腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移特性。

1.3劃痕實(shí)驗(yàn)

劃痕實(shí)驗(yàn)可用于侵襲和遷移，劃痕實(shí)驗(yàn)是先將腫瘤細(xì)胞接種，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿時(shí)，用移液槍尖等在貼壁細(xì)胞上劃線，PBS沖洗，鏡下觀察劃痕并拍照、標(biāo)記，測(cè)量劃痕邊緣相對(duì)距離；繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，終止培養(yǎng)后在鏡下觀察劃痕的狀態(tài)，拍照并測(cè)量，計(jì)算遷移距離，根據(jù)細(xì)胞遷移距離即可判斷細(xì)胞的侵襲和遷移特性。劃痕實(shí)驗(yàn)的方法簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)儀器簡(jiǎn)單，可量化腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移特性；但實(shí)驗(yàn)中的不可控因素影響結(jié)果可靠性。

2.實(shí)驗(yàn)技術(shù)改進(jìn)建議

在腫瘤細(xì)胞的侵襲性與遷移性研究中，以上的幾種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在一定程度上都能對(duì)侵襲性和遷移性做出較為準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)，針對(duì)其優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行改進(jìn)，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠。

Western blot實(shí)驗(yàn)可定量檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，但是此種方法無(wú)法定位蛋白在細(xì)胞中的位置，如果一旦蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的部位發(fā)生變化，研究者無(wú)法獲得相應(yīng)的結(jié)果。因此可用免疫組化的方法定位蛋白的位置，作為Western blot的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，兩種實(shí)驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合不僅可量化目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平，還能在細(xì)胞中定位目標(biāo)蛋白的表達(dá)位置。

Transwell小室要嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟，認(rèn)真仔細(xì)的操作，要求在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)當(dāng)考慮全面，如培養(yǎng)基中小牛血清等物質(zhì)會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移，所以在實(shí)驗(yàn)中，小室內(nèi)部應(yīng)當(dāng)使用無(wú)血清培養(yǎng)基，小室外使用含少量血清的培養(yǎng)基，腫瘤細(xì)胞的趨化性會(huì)誘導(dǎo)其向小室外遷移。為了模擬腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的狀態(tài)，在接種腫瘤細(xì)胞之前，在小室內(nèi)鋪上一層基質(zhì)膠模擬人體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)，腫瘤細(xì)胞需要分泌一些侵襲和遷移相關(guān)的蛋白將基質(zhì)膠溶解，才能遷移到小室外。Transwell小室測(cè)定法在改進(jìn)之后，腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移時(shí)所處的環(huán)境更加近似人體內(nèi)部，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠。

與以上幾種實(shí)驗(yàn)技術(shù)相比，劃痕實(shí)驗(yàn)對(duì)設(shè)備儀器的要求較低，為了提高劃痕實(shí)驗(yàn)可靠性，實(shí)驗(yàn)人員首先要對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程熟悉，還應(yīng)注意以下幾點(diǎn)，在劃痕時(shí)用槍尖靠著直尺劃線，得到的劃痕較為均勻和筆直；同一個(gè)樣本的不同位置重復(fù)劃線，計(jì)算遷移距離時(shí)多取幾個(gè)點(diǎn)，降低實(shí)驗(yàn)的誤差。

腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移特性的研究對(duì)于腫瘤的臨床治療有著重要的現(xiàn)實(shí)意義，而實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)于基礎(chǔ)研究的發(fā)展是非常重要的，對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行改革，可有效的推動(dòng)基礎(chǔ)研究的進(jìn)展。研究腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移特性的幾種實(shí)驗(yàn)技術(shù)各有其優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際工作中，科研工作者可根據(jù)自身的實(shí)際情況，將幾種常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，取長(zhǎng)補(bǔ)短，得到的結(jié)果的可信度會(huì)更高。

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【基金項(xiàng)目：興義民族師范學(xué)院資源植物學(xué)教學(xué)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目；貴州省科技廳聯(lián)合基金項(xiàng)目，倒提壺生物學(xué)特性和繁育技術(shù)研究（項(xiàng)目合同編號(hào)：黔科合LH字[2014]7417號(hào)）；貴州省教育廳基金項(xiàng)目（黔教合KY字[2014]327號(hào)）；貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項(xiàng)（黔科合中藥字[2013]5038號(hào)）；黔科合人才團(tuán)隊(duì)字[2013]30。】endprint