張金婷 王淑民 白兢毳 杜淑英 李巧鳳 朱曉紅 張 斌 王 寧＊張樹成

1.河北省承德縣婦幼保健和計(jì)劃生育技術(shù)服務(wù)中心（067400）；2.北京市朝陽區(qū)太陽宮社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心；3.河南省新密市婦幼保健和計(jì)劃生育技術(shù)服務(wù)中心；4.國家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所

補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方藥對(duì)排卵障礙不孕患者子宮內(nèi)膜的影響

張金婷1王淑民1白兢毳2杜淑英3李巧鳳3朱曉紅4張 斌4王 寧4＊張樹成4

1.河北省承德縣婦幼保健和計(jì)劃生育技術(shù)服務(wù)中心（067400）；2.北京市朝陽區(qū)太陽宮社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心；3.河南省新密市婦幼保健和計(jì)劃生育技術(shù)服務(wù)中心；4.國家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所

目的：觀察補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方藥對(duì)子宮內(nèi)膜的影響。方法：對(duì)排卵障礙不孕婦女45例，采用服藥前后自身對(duì)照方法，通過中藥方藥治療和隨訪各3個(gè)周期，進(jìn)行臨床觀察和B超檢測(cè)；服藥前后分別于增殖晚期、分泌中期和分泌晚期刮取子宮內(nèi)膜進(jìn)行形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)檢測(cè)。結(jié)果：服藥后月經(jīng)、排卵、子宮內(nèi)膜等均有改善，總?cè)焉锫蕿?5.6%；子宮內(nèi)膜的腺體細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)與月經(jīng)周期發(fā)育各個(gè)時(shí)同步化能力和8種細(xì)胞因子的表達(dá)均較服藥前明顯增強(qiáng)。結(jié)論：補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方藥可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜發(fā)育，改善子宮內(nèi)膜的接受性，提高內(nèi)膜細(xì)胞活性，從而提高妊娠率。關(guān)鍵詞 補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)，子宮內(nèi)膜，卵泡發(fā)育，妊娠率，形態(tài)學(xué)

子宮內(nèi)膜對(duì)孕卵的接受性（子宮內(nèi)膜感受態(tài)）對(duì)妊娠的建立十分重要。在多數(shù)妊娠失敗病例中除了胚胎因素外，子宮內(nèi)膜發(fā)育不佳、不能達(dá)到接受狀態(tài)成為影響輔助生殖成功的主要因素之一。使用激素類進(jìn)行促（超）排卵藥物，可以在受體水平上阻斷雌激素作用，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜DNA合成受阻，造成患者子宮內(nèi)膜發(fā)育遲緩，內(nèi)膜與卵泡發(fā)育不同步。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)注重整體調(diào)理，采用中西醫(yī)結(jié)合治療方法被更多嘗試在超排卵、輔助生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。中藥復(fù)方具有改善排卵能力，促進(jìn)卵泡發(fā)育，同時(shí)可以同步調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性和輸卵管功能，促進(jìn)受孕成功多環(huán)節(jié)的內(nèi)環(huán)境。meta分析和系統(tǒng)評(píng)價(jià)基于目前的證據(jù)可以說明復(fù)方中藥干預(yù)輔助生殖技術(shù)具有良好的效果和安全性，可提高臨床妊娠率、受精率、種植率和優(yōu)秀胚胎率，降低流產(chǎn)率［1］。通過前期臨床觀察，補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方藥具有明確的調(diào)經(jīng)、促排卵、健內(nèi)膜作用［2］。為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方的作用，本文對(duì)子宮內(nèi)膜的病理學(xué)變化和相關(guān)因子的免疫組化進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 觀察對(duì)象

根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)［34］選擇因排卵障礙不孕婦女45例為觀察對(duì)象。受試者平均年齡28.3（22～36）歲，平均不孕年限3.3（2～11.5）年；原發(fā)、繼發(fā)性不孕分別為22、23例，月經(jīng)周期39～60d；主要表現(xiàn)為卵泡發(fā)育生長緩慢、停育、變性、無優(yōu)勢(shì)卵泡和子宮內(nèi)膜薄、分泌期子宮內(nèi)膜反應(yīng)比正常月經(jīng)周期相差兩天以上等。受試者半年內(nèi)無甾體激素藥物或其它影響生殖的中西藥物使用，有至少3個(gè)月經(jīng)周期明確記錄，常規(guī)婦科檢查正常，排除器質(zhì)性病變；有完整的內(nèi)分泌性激素測(cè)定結(jié)果；有至少一個(gè)周期的連續(xù)B超監(jiān)測(cè)結(jié)果。男方發(fā)育正常，精液檢查正常；雙方免疫性不育因素均經(jīng)過檢查和治療顯示正常。

1.2 藥方

補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方藥為協(xié)定處方，功能為補(bǔ)腎填精、養(yǎng)血活血、調(diào)經(jīng)助孕，由當(dāng)歸、菟絲子、枸杞子、女貞子、覆盆子、山萸肉、何首烏、巴戟天、熟地、山藥、甘草等組成［2］，水煎服，每日1劑，分2次服用。

1.3 治療和觀察方法

采用自身對(duì)照方法觀察。治療前，觀察對(duì)象連續(xù)記錄3個(gè)月經(jīng)周期，并行≥2個(gè)周期的B超監(jiān)測(cè)，選擇3個(gè)觀察周期中最接近正常的臨床指標(biāo)作為對(duì)照數(shù)據(jù)。于月經(jīng)第5d開始服用補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方藥，根據(jù)連續(xù)B超監(jiān)測(cè)確定排卵日，記錄卵泡大小和子宮內(nèi)膜厚度。當(dāng)有排卵發(fā)生即停止服用中藥，若連續(xù)服用18d仍未排卵發(fā)生時(shí)服用至月經(jīng)周期第23d停止服藥；若妊娠不再服用中藥行妊娠期觀察。若未妊娠次月第5天繼續(xù)服用中藥。連續(xù)服用中藥3個(gè)周期，作為治療后數(shù)據(jù)分析并繼續(xù)隨訪觀察3個(gè)周期。1.4子宮內(nèi)膜樣本采集和處理

以B超監(jiān)測(cè)確定的排卵日為LH 0，排卵前2d為LH－2（增殖晚期），排卵后7天和10天分別為LH＋7（分泌中期）和LH＋10（分泌晚期）。在治療前和治療后第2個(gè)周期分別于增殖晚期、分泌中期、分泌晚期子宮內(nèi)膜取材，每名觀察對(duì)象僅選取1個(gè)時(shí)相在治療前和治療后相同時(shí)相取材。將觀察對(duì)象隨機(jī)分為增殖晚期、分泌中期、分泌晚期共3個(gè)內(nèi)膜取材時(shí)相，服藥前分別為18、16、11例，共45例；服藥后分別為各12、10、10例，共32例（其他13例失訪或未能獲得取材組織）。子宮內(nèi)膜組織經(jīng)Bouin固定，經(jīng)常規(guī)水洗、脫水、浸蠟、包埋、5μm石蠟切片，行常規(guī)蘇木精－伊紅（HE）染色，脫水，透明，封片，鏡檢。根據(jù)文獻(xiàn)［5］標(biāo)準(zhǔn)確定子宮內(nèi)膜組織學(xué)分期。

1.5 免疫組化染色和分析

免疫組化染色方法采用SP法，封閉血清為正常山羊血清，一抗購自R＆D或abcam公司?？贵w滴度1200～1800，3%的過氧化氫封閉。加一抗于4℃孵育過夜，使用通用型生物素標(biāo)記的二抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素S－A／HRP工作液，DAB顯色，陰性對(duì)照一抗為正常羊血清。進(jìn)行13種因子的免疫組化，分別為雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、雌激素調(diào)節(jié)蛋白（PS2）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及受體（VEGFR）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）及受體（TGFR）、表皮生長因子受體（EGFR）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、纖維連接蛋白（FN）、層粘連蛋白（LN）及受體（LNR）。免疫組織化學(xué)染色采用雙盲法根據(jù)陽性反應(yīng)顆粒強(qiáng)度和分布程度進(jìn)行定性分析，特異性著染強(qiáng)度以陰性（－）、弱陽性（±）、陽性（＋）、強(qiáng)陽性（2＋）、極強(qiáng)陽性（3＋、4＋）表示。

1.6 資料整理和統(tǒng)計(jì)分析

卵泡測(cè)定以（長徑×短徑）12換算為卵泡標(biāo)準(zhǔn)大小。采用SPSS11.5軟件包處理數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單因素方差分析、配對(duì)資料t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 妊娠和流產(chǎn)情況

45例觀察對(duì)象，服藥后1、2、3個(gè)周期和隨訪觀察1、2、3個(gè)周期分別妊娠2、6、4例和2、1、1例，累計(jì)妊娠率分別為4.4%（2／45）、17.8%（8／45）、26.7%（12／45）和31.1%（14／45）、33.3%（15／45）、35.6%（16／45）；服藥3個(gè)周期內(nèi)妊娠率為26.7%（12／45），隨訪觀察3個(gè)周期內(nèi)妊娠率為12.1%（4／33），總?cè)焉锫蕿?5.6%（16／45）。共有2例（2／16）發(fā)生流產(chǎn)。

2.2 月經(jīng)變化

所有觀察對(duì)象服藥前均月經(jīng)不調(diào)。服藥后各觀察時(shí)期月經(jīng)不調(diào)和月經(jīng)性狀明顯改善（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

2.3 排卵情況

不同服藥時(shí)期卵泡發(fā)育情況比較，均顯示服藥后卵泡發(fā)育明顯改善（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

表1 觀察對(duì)象服藥前后月經(jīng)情況變化比較［例（%）］

表2 觀察對(duì)象服藥前后卵泡發(fā)育和排卵變化比較

2.4 子宮內(nèi)膜發(fā)育情況

服藥前和服藥后1、2、3個(gè)周期子宮內(nèi)膜厚度在LH－2時(shí)分別為6.7±2.1、8.2±1.8、9.1±1.9、9.5± 2.3mm，在LH0時(shí)分別為7.1±1.9、8.8±1.6、9.6± 1.9、10.6±2.2mm，服藥后子宮內(nèi)膜發(fā)育好于服藥前（P＜0.05或P＜0.01）。

2.5 子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)變化

2.5.1 LH－2 此期共12例。在服藥前，內(nèi)膜增殖表現(xiàn)不良11例（增中期2例、后期2例、末期4例、晚增前期3例），腺體數(shù)目少、分布疏松不均勻；腺腔分化程度低，腺腔小而圓，腺體功能差；顯示形態(tài)學(xué)滯后、正常發(fā)育狀態(tài)不同步11例；處于正常增殖子宮內(nèi)膜僅1例。在服藥后，內(nèi)膜增殖表現(xiàn)不良3例（中增末期1例、晚增前期2例），正常晚增中期9例。子宮內(nèi)膜發(fā)育不良者服藥后比服藥前減少了8例（8／12）（P＜0.01）。

2.5.2 LH＋7 此期共10例。在服藥前，8例內(nèi)膜發(fā)育不良，表現(xiàn)為仍停留在增殖期，腺上皮仍為假復(fù)層；腺體細(xì)胞小，數(shù)目少，彎曲擴(kuò)大程度低；間質(zhì)主要為細(xì)胞數(shù)目較少，梭形（小細(xì)胞）和星形（大細(xì)胞）細(xì)胞同時(shí)可見各占50%左右；小動(dòng)脈和血管增生不明顯；處于正常分泌表現(xiàn)者2例。在服藥后，內(nèi)膜發(fā)育不良1例；符合正常分泌特征表現(xiàn)者9例，內(nèi)膜中腺體發(fā)育充分，出現(xiàn)核下空泡，頂漿分泌的細(xì)胞減少；間質(zhì)細(xì)胞水腫明顯。子宮內(nèi)膜發(fā)育不良者服藥后比服藥前減少了7例（7／10）（P＜0.01）。

2.5.3 LH＋10 此期共10例。服藥前，10例內(nèi)膜均發(fā)育不良，處在中泌期（初期、中期），子宮內(nèi)膜發(fā)育不同步，滯后于正常晚泌的狀態(tài)，子宮內(nèi)膜的腺體擴(kuò)張彎曲程度低，頂漿分泌和核下空泡偶見；在間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目少，細(xì)胞分化延遲，小動(dòng)脈和血管增生不明顯。在服藥后，正常發(fā)育內(nèi)膜7例，內(nèi)膜發(fā)育不良3例。子宮內(nèi)膜發(fā)育不良者服藥后比服藥前減少了7例（7／10）（P＜0.01）。

2.6 子宮內(nèi)膜活性因子的影響

進(jìn)行了13種因子的免疫組化分析，主要分為3種類型：細(xì)胞生長因子及生長因子受體類（VEGF、VEGFR、TGF、TGFR、EGFR、FGF；細(xì)胞粘附分子類（FN、LN及LNR）和其他（ER、PR、PS2和PCNA）。見表3。①細(xì)胞生長因子及受體：EGFR、TGF在排卵前后表達(dá)強(qiáng)度逐漸增加（分泌晚期比分泌中期、增殖晚期強(qiáng)），TGFR排卵后表達(dá)強(qiáng)度逐漸降低（分泌晚期比分泌中期弱）。與服藥前相比，服藥后增殖晚期的EGFR表達(dá)明顯增強(qiáng)；分泌中期、分泌晚期組EGFR略有增強(qiáng)，VEGF增強(qiáng)，F(xiàn)GF明顯增強(qiáng)。服藥前后TGF、TGFR、VEGFR均無變化。②細(xì)胞粘附因子：服藥后與服藥前比較，LN、LNR在各組均明顯增強(qiáng)；FN在各組表達(dá)均陽性，F(xiàn)N在增殖晚期、分泌中期組明顯增強(qiáng)。③其它相關(guān)因子：PR排卵前后（增殖晚期～分泌晚期）強(qiáng)度逐漸降低（增殖晚期比分泌中期表達(dá)高，分泌晚期不表達(dá)）。服藥前后比較PCNA、PS2在各組均為服藥后明顯增強(qiáng)，ER在增殖晚期、分泌中期組服藥后明顯增強(qiáng)，PR在增殖晚期組服藥后明顯增強(qiáng)、在分泌中期組服藥后略有增強(qiáng)。見表3。

表3 觀察對(duì)象不同時(shí)期各細(xì)胞因子免疫組化表達(dá)定性分析

3 討論

人子宮內(nèi)膜因取材受限影響了在體觀察以及中藥治療效果的全面評(píng)價(jià)，故以往的相關(guān)研究多集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，而采用離體人子宮內(nèi)膜進(jìn)行研究是目前最理想的手段。中醫(yī)藥強(qiáng)調(diào)整體辨證施治，對(duì)不育癥的治療突出局部作用又兼顧整體效果，在臨床上取得了較好的療效［67］。本研究在中醫(yī)“腎主生殖”“腎藏精”“精滿則子宮易于攝精，血足則子宮易于容物”的理論指導(dǎo)下，通過調(diào)經(jīng)孕育方藥對(duì)排卵障礙性不孕患者子宮內(nèi)膜組織形態(tài)進(jìn)行觀察，研究中藥對(duì)“植入窗口期”子宮內(nèi)膜感受態(tài)變化的影響，探討中藥對(duì)子宮內(nèi)膜刺激作用的機(jī)制。

在正常婦女月經(jīng)周期的整個(gè)增殖期內(nèi)，上皮和間質(zhì)細(xì)胞分裂增殖，內(nèi)膜功能層生長增厚，功能活躍旺盛。旺盛的分泌反應(yīng)，為精子的運(yùn)行和獲能提供了基本的適宜條件，是胚胎著床的基本保證。胚泡的正常植入需要子宮內(nèi)膜處于感受狀態(tài)，子宮內(nèi)膜接受性的改善可能涉及改善子宮內(nèi)膜蛻膜化反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞因子和生長因子的分泌、增加子宮內(nèi)膜和胚胎發(fā)育的協(xié)調(diào)性等方面［8］。

內(nèi)膜中活性物質(zhì)的協(xié)調(diào)和表達(dá)對(duì)著床的成立極為重要，這些活性物質(zhì)主要為激素、激素受體、早孕相關(guān)因子和早孕相關(guān)因子受體。細(xì)胞因子可以介導(dǎo)甾體激素對(duì)子宮內(nèi)膜的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)不孕婦女服用補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方后，方藥促進(jìn)調(diào)節(jié)此期內(nèi)膜活性物質(zhì)的變化。在增殖晚期有10種增強(qiáng)，EGFR、LN、LNR、FN、PS2、ER、PR、PCNA等8種明顯增強(qiáng)，這8種因子主要與促進(jìn)細(xì)胞增殖分化、與激素和細(xì)胞粘附相關(guān)［911］。通過這些因子的作用，影響子宮內(nèi)膜的生理狀態(tài)和胚胎植入的局部微環(huán)境，改善子宮內(nèi)膜的容受性，有利于對(duì)著床的過程進(jìn)行精細(xì)的調(diào)控［12］。

本研究所觀察的細(xì)胞因子（VEGF、TGF、FGF、VEGFR、TGFR、EGFR）同時(shí)也是促血管生成因子。在子宮內(nèi)膜發(fā)育的不同時(shí)相均有表達(dá)，服用中藥后增殖晚期、分泌中期、分泌晚期具有不同強(qiáng)度的增強(qiáng)，這些結(jié)果提示不孕婦女服用補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方藥后，促血管生成活性明顯增強(qiáng)，符合正常生理狀態(tài)下“血”、“脈”充沛盈盛表現(xiàn)。從微觀角度看，服用中藥后增殖期的內(nèi)膜分化增殖能力明顯改善，內(nèi)膜明顯增厚，增殖旺盛；分泌期子宮內(nèi)膜發(fā)育同步，分泌晚期細(xì)胞分泌活動(dòng)增強(qiáng)；相應(yīng)時(shí)相標(biāo)志性細(xì)胞因子表達(dá)增加，細(xì)胞活性增加。顯示出補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方整體調(diào)節(jié)作用的優(yōu)勢(shì)。補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性的精密機(jī)制以及提高妊娠率的協(xié)調(diào)機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

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［責(zé)任編輯：董 琳］

Influence of Bushen Tiaojing Decoctin on endometrium of infertile women with ovulation failure

ZHANG Jinting1，WANG Shumin1，BAI Jingcui2，DU Shuying3，LI Qiaofeng3，ZHU Xiaohong4，ZHANG Bin4，WANG Ning4＊，ZHANG Shucheng4
1.Maternal＆child and Family Planning Service Center of Chengde County，Hebei，067400；2.Community Health Service Center of Chaoyang district，Beijing；3.Maternal＆child and Family Planning Service Center of Xinmi city，Henan；4.National Research Institute for Family Planning，Beijing
＊

wangn333＠126.com

Objective：To investigate the influence of Bushen Tiaojing Decoction on endometrium.Methods：Forty five infertile women with ovulation failure were included and observed by self－control method before and after taking Bushen Tiaojing Decoction.All women were followed up 3months after taking medicine，and the outcomes were obtained by observation of clinical symptoms and ultrasound.The endometria of included women were collected for morphological and immunohistochemical detection before and after medicine in late proliferation stage，mid secretory and late secretory stage.Results：Bushen Tiaojing Decoction regulated menstruation，promoted ovulation，and enhanced endometrial development.The total pregnancy rate was 35.6%in these women.The development of gland and the stromal cells synchronized with the menstrual cycle，and eight cytokines were highly expressed after treatment，so it indicated endometria activity and function increased.Conclusion：Bushen Tiaojing Decoction can promote endometrial development，improve endometrial receptivity，and improve pregnancy rate of infertile women.

Bushen Tiaojing；Endometrium；Pregnant rate；Morphology

10.3969／j.issn.1004－8189.2017.04.004

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃，2010CB530403）；國家自然科學(xué)基金（90409016）

2017－02－13

2017－02－23

＊通訊作者：wangn333＠126.com