張培榮+徐加譽+廖子龍

【摘要】 目的 分析在薄層液基細胞制片上改良抗酸染色的陽性檢出率。方法 選取128例結核患者， 標本種類為胸腹水、支氣管灌洗液、痰、心包積液及腦脊液， 薄層液基細胞制片后分別采用改良抗酸染色方法、傳統(tǒng)抗酸染色方法及實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）結核檢測方法， 對細胞標本三種檢測結果進行比較。結果 薄層液基細胞制片改良抗酸染色的陽性率為49.2%， 明顯高于傳統(tǒng)抗酸染色陽性率的33.6%， 差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=6.440， P<0.05）。薄層液基細胞制片實時熒光定量PCR與傳統(tǒng)抗酸染色陽性率比較， 差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.667， P>0.05）。薄層液基細胞制片改良抗酸染色檢測陽性率高于實時熒光定量PCR， 但差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.576， P>0.05）。結論 對于早期結合患者，薄層液基細胞制片改良抗酸染色的檢測陽性率明顯較高， 是一種早期診斷結核的可靠有效方法。

【關鍵詞】 改良抗酸染色；早期結核；診斷價值

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.22.017

在臨床工作中早期結核疾病診斷是臨床醫(yī)生棘手的問題之一， 隨著艾滋病、免疫抑制劑的應用及結核耐藥菌株出現(xiàn)， 結核的發(fā)病率明顯上升， 與其他疾病相比早期結核的臨床癥狀日趨不典型性， 易引起臨床預估不準， 導致初步診斷時遺漏病變或誤診腫瘤性疾病， 結核的早期診斷對臨床治愈具有十分重要意義， 抗酸染色操作簡單， 檢測時間短， 被公認為診斷結核的有效使用方法， 但目前陽性率偏低， 困擾臨床推廣及應用， 如何提高抗酸染色的陽性率一直是病理醫(yī)生研究的課題之一， 本項科研課題主要研究液基細胞標本應用改良抗酸染色方法確定結核診斷， 與傳統(tǒng)抗酸染色及PCR檢測結核的方法進行比較， 進行早期結核的診斷陽性率分析。

1 材料與方法

1. 1 材料來源 選取本院2015年3月～2016年10月的128例結核患者為檢測對象， 其中男80例， 女48例， 年齡19～97歲， 平均年齡47歲， 標本種類為胸腹水、支氣管灌洗液、痰、心包積液及腦脊液。

1. 2 方法 薄層液基細胞制片后分別采用改良抗酸染色方法、傳統(tǒng)抗酸染色方法及實時熒光定量PCR結核檢測方法。

1. 2. 1 實時熒光定量PCR檢測方法 應用Eppdorf熒光定量PCR儀， 取單管單人份PCR反應管3份， 直接加入處理后樣品、陰性質(zhì)控品及陽性質(zhì)控品2 ?l， 8000 rpm離心數(shù)秒， 放入PCR儀擴增， 擴增條件：93℃2 min預變性， 93℃45 s～55℃120 s， 反應10個循環(huán)后置33℃保溫， 迅速逐個將反應管放入熒光檢測儀， 最后93℃45 s～55℃120 s， 共做30個循環(huán)后置33℃保溫。

1. 2. 2 改良抗酸染色及傳統(tǒng)抗酸染色方法 操作步驟：新柏氏2000薄層液基細胞制片， 滴入苯酚堿性品紅液， 微波爐中低火8 min（傳統(tǒng)方法：滴入苯酚堿性品紅液室溫30 min）， 20%硫酸水溶液分化1～5 min， Mayer蘇木素復染。

1. 3 陽性檢測標準

1. 3. 1 結核PCR陽性標準 在實驗有效的前提下， 結核PCR檢測陽性AxP1-N）， 如果P1-N）>AxP1-N）則屬于實驗灰度區(qū)， 需重復實驗1次， 若重復結果AxP1-N）應用判為陽性， 否則為陰性。

1. 3. 2 抗酸染色陽性標準 采用萋尼氏染色法（Z-N）鏡檢結果分級報告標準， 抗酸桿菌陰性：連續(xù)觀察300個不同視野， 未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌。抗酸桿菌陽性， 報告抗酸桿菌菌數(shù)：1～8條抗酸桿菌/300視野或抗酸桿菌陽性（1+）， （2+）， （3+）， （4+）均視為陽性。

1. 4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2. 1 薄層液基細胞制片改良抗酸染色及傳統(tǒng)抗酸染色方法檢測結果比較 薄層液基細胞制片改良抗酸染色的陽性率為49.2%， 明顯高于傳統(tǒng)抗酸染色陽性率的33.6%， 差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=6.440， P<0.05）。見表1。

2. 2 薄層液基細胞制片實時熒光定量PCR與傳統(tǒng)抗酸染色檢測結果比較 薄層液基細胞制片實時熒光定量PCR與傳統(tǒng)抗酸染色陽性率比較， 差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.667， P>0.05）。見表2。

2. 3 薄層液基細胞制片改良抗酸染色與實時熒光定量PCR檢測結果比較 薄層液基細胞制片改良抗酸染色檢測陽性率高于實時熒光定量PCR， 但差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.576， P>0.05）。表3。

3 討論

世界衛(wèi)生組織全球結核病最新報告指出， 2013年全球約有900萬例活動性結核病患者， 150萬例病死。中國結核病發(fā)病率僅次于印度及俄羅斯， 特別是耐藥結核的出現(xiàn)， 嚴重影響人們的健康及經(jīng)濟發(fā)展[1， 2]。用于結核診斷的方法中細菌學檢測需要時間長， 生物安全級別要求較高， 血清學試驗檢測結核抗原或抗體不太理想。實時熒光定量PCR結核探針檢測結核桿菌的存在， 特異性比較高， 但敏感性不理想， 主要是目前結核分枝桿菌的基因變異性較大， 檢測時間較長， 目前臨床醫(yī)生仍以抗酸染色為結核檢測。 臨床上和流行病學中常用查見抗酸桿菌作為結核病診斷的依據(jù)[3]， 隨著臨床醫(yī)療水平的提升， 典型結核疾病易于臨床診斷， 能得到及時有效治療， 但目前結核臨床癥狀呈現(xiàn)不典型性， 導致錯過最佳治療階段， 早期結核疾病的診斷尤為重要。無創(chuàng)及微創(chuàng)下痰、 尿、 穿刺組織液、 胸腹水等液基細胞為早期結核診斷提供理想標本， 此方法操作簡單， 經(jīng)濟快速制片， 分枝桿菌富集效果好， 提高抗酸染色陽性率是本次科研課題的主要研究目的。

本次實驗采集臨床確診結核患者的痰檢、 支氣管刷檢， 肺泡灌洗液、 胸腹水、 心包積液等標本， 128例液基細胞制片后分別進行傳統(tǒng)抗酸染色及改良抗酸染色方法， 同一病例實時熒光定量PCR應用結核探針進行檢測， 對三種實驗方法的結果進行比較分析， 三種方法（改良抗酸染色、傳統(tǒng)抗酸染色及實時熒光定量PCR檢測）陽性率分別為49.2%， 33.6%， 41.4%， 前兩種檢測陽性率比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）， 改良抗酸染色與實時熒光定量PCR檢出陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）， 改良抗酸染色陽性率稍高于實時熒光定量PCR陽性率， 操作簡單經(jīng)濟， 仍然視為結核檢測首選方法。實時熒光定量PCR檢測結核的特異性非常高， 實時熒光定量PCR技術可以檢出組織中結核分枝桿菌[4]， 但不能同時檢測出非結核分枝桿菌， 本實驗結果比王旭洲等[5]熒光定量 PCR檢測陽性率（51.50%）低。Agarwal等[6]報道如果標本處理不當或檢測程序不規(guī)范， 有可能會造成假陰性或者假陽性， 本次實驗結核探針PCR檢測的陽性率可能與此類因素有關。傳統(tǒng)抗酸染色的陽性率明顯低于改良抗酸染色， 本研究結果明顯高于楊銘等[7]報道的 16.33%， 本次實驗的傳統(tǒng)抗酸染色與改良抗酸染色陽性率均有增高， 可能與標本制片程序較少、 細菌富集有關。

病理組織切片經(jīng)過固定、脫水、浸蠟等程序易對結核桿菌造成破壞， 而液基細胞制片相對操作程序較少， 抗酸染色陽性結核分枝桿菌形態(tài)明顯易見。此種方法把液基細胞技術與改良抗酸染色有機結合， 一方面在無創(chuàng)及微創(chuàng)下易于采集到早期診斷結核疾病的理想標本， 易于被患者接受；另一方面此種實驗方法明顯提高早期結核診斷陽性率， 檢測時間短， 成本較低， 操作簡單， 最適合基層醫(yī)院推廣的早期結核檢測最佳方法。

目前抗酸染色陽性被認為是診斷結核的金標準， 查找文獻有研究報道目前存在非結核分枝桿菌在抗酸染色陽性時鏡下形態(tài)十分相似， 因此， 在抗酸染色陽性的病例必須結合臨床特征及相應檢查結果明確診斷。

綜上所述， 在液基細胞制片下改良抗酸染色是目前檢測早期結核的易于患者接受、 有效的檢測方法， 能明顯提高早期結核檢出率， 實現(xiàn)臨床對結核疾病的早診早治， 提高臨床治愈率。

參考文獻

[1] Pichenda K， Nakamura K， Morita A， et al. Non-hospital DOT and early diagnosis of tuberculosis reduce costs while achieving treatment success. Int J Tuberc Lung Dis， 2012， 16（6）： 828-834.

[2] Zhao Y， Ou X， Pang Y， et al. National Survey of Drug-Resistant Tuberculosis in China//2012科學研究與結核病防治高峰論壇， 2012：2161-2170.

[3] 馬玙， 朱莉珍， 潘毓萱. 結核病. 北京：人民衛(wèi)生出版社， 2009：100-104.

[4] 石新蘭， 張寧， 崔鐵莉， 等. 血性/炎性涂片背景對宮頸液基細胞學診斷的影響. 臨床與實驗病理學雜志， 2012， 28（7）：810-812.

[5] 王旭洲， 謝飛來， 鄭智勇. 熒光定量PCR檢測結核/非結核分枝桿菌在肉芽腫病理診斷中的應用. 臨床與實驗病理學雜志， 2013， 29（8）：884-887.

[6] Agarwal A. Comparative Evaluation of BacT/ALERT 3D Culture Medium and Nested PCR in the Diagnosis of Tuberculous Meningitis. Saarc Tuberculosis & Hiv/aids Centre， 2015（11）：15-20.

[7] 楊銘， 岳冀， 李曦， 等. 纖維支氣管鏡在支氣管結核診斷中的應用價值分析. 四川醫(yī)學， 2012， 33（8）：1394-1395.

[收稿日期：2017-03-30]