占大錢， 呂 青， 陳華文， 靜 亮， 馮 俊， 祝 偉△

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院急診內(nèi)科，武漢 430030 2華中科技大學同濟醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學系，武漢 430030

SIRT2對膿毒癥小鼠遠期抑郁的影響及其機制研究*

占大錢1， 呂 青2， 陳華文1， 靜 亮1， 馮 俊1， 祝 偉1△

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院急診內(nèi)科，武漢 4300302華中科技大學同濟醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學系，武漢 430030

目的 探討沉默信息調(diào)節(jié)基因2(SIRT2)對膿毒癥小鼠遠期抑郁的影響及其機制。方法 腹腔注射內(nèi)毒素(LPS)制備膿毒癥小鼠模型，實驗動物隨機分成3組：對照組(Control)、膿毒癥組(LPS)、干預組(AGK2+LPS)。通過懸尾實驗、強迫游泳實驗和糖水偏好實驗來評估小鼠抑郁狀況，Western blot法檢測小鼠腦內(nèi)海馬組織SIRT2和乙?；艘蜃?κB(NF-κB)蛋白表達，免疫熒光法檢測小鼠腦內(nèi)海馬組織Iba1活性，ELISA法測定海馬組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)水平。結(jié)果 膿毒癥小鼠遠期出現(xiàn)明顯的抑郁相關(guān)表現(xiàn)，腦組織SIRT2蛋白表達水平降低，乙?；疦F-κB p65蛋白表達明顯增加，小膠質(zhì)細胞活化增加，腦組織內(nèi)TNF-α和IL-1β水平增加(P<0.05，P<0.01)。SIRT2特異性抑制劑AGK2抑制腦組織內(nèi)SIRT2的表達(P<0.01)，而且乙?；疦F-κB p65蛋白表達、小膠質(zhì)細胞活化和腦組織內(nèi)TNF-α和IL-1β水平均進一步增加(P<0.05，P<0.01)，遠期抑郁相關(guān)表現(xiàn)也明顯加重(P<0.01)。結(jié)論 在膿毒癥小鼠中，SIRT2表達下降抑制NF-κB去乙?；?，進而加重大腦組織炎癥反應(yīng)和遠期抑郁。

沉默信息調(diào)節(jié)基因2； 核因子-κB； 抑郁； 膿毒癥

膿毒癥是重癥監(jiān)護病房(ICU)患者死亡的主要原因，占10%到50%[1]。膿毒癥相關(guān)性腦病(septic associated encephalopathy，SAE)是由膿毒癥引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)彌散性功能障礙，是ICU常見的臨床綜合征，發(fā)病率高達70%，主要表現(xiàn)為精神狀態(tài)和認知功能的改變。膿毒癥患者一旦合并SAE，其病死率將顯著增加，可高達49%[2-3]。

SAE可引起急性和慢性認識和情感障礙。譫妄是最易發(fā)現(xiàn)的急性表現(xiàn)，膿毒癥存活患者數(shù)年后仍有認識和情感障礙[4]。目前，SAE具體機制尚未完全清楚，臨床上對其也缺乏有效的治療措施。沉默信息調(diào)節(jié)基因2(silent information regulator 2，SIRT2)是依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的組蛋白脫乙酰酶，為Sirtuins家族成員之一，其在腦組織中含量豐富，在多種神經(jīng)變性疾病及神經(jīng)炎癥反應(yīng)中有重要作用[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)：SIRT2與阿爾茨海默病患者抑郁發(fā)生密切相關(guān)[7]。本研究旨在進一步探討SIRT2對膿毒癥小鼠遠期抑郁的影響及其機制。

1 材料和方法

1.1 動物和實驗材料

60只雄性C57BL/6小鼠，體重20～25 g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部提供。所使用藥物和試劑：內(nèi)毒素(LPS，serotype 055：B5，Sigma，美國)；SIRT2特異性抑制劑AGK2(EMD Millipore，美國)；TNF-α ELISA試劑盒(CUSABIO，中國)；IL-1β ELISA試劑盒(R&D Systems，美國)；Iba1抗體(1∶500；Wako Chemicals，美國)；SIRT2抗體(Sigma，美國)；乙?；疦F-κB p65抗體(Abcam，美國)。

1.2 動物模型和分組

60只小鼠隨機分成3組：對照組(Control)、膿毒癥組(LPS)、干預組(AGK2+LPS)，每組各20只。腹腔注射LPS制備膿毒癥小鼠模型。對照組小鼠腹腔注射PBS(10 mL/kg)，膿毒癥和干預組小鼠腹腔注射LPS(5 mg/kg)。干預組小鼠于腹腔注射LPS前2 h予腹腔注射AGK2(82 mg/kg)，膿毒癥小鼠予腹腔注射二甲基亞砜(DMSO)作為對照。各組取10只小鼠于膿毒癥模型建立后第3天處死，留取腦組織標本供相關(guān)指標檢測，各組10只小鼠于膿毒癥模型建立后第28和29天進行行為學檢測[8]。

1.3 行為學觀察

按照既往研究的實驗步驟，進行懸尾實驗、強迫游泳實驗和糖水偏好實驗。行為學觀察嚴格按照相關(guān)實驗要求進行[8]。

1.4 Western blot法檢測腦組織內(nèi)SIRT2和乙?；疦F-κB水平

取-20℃保存的海馬組織200 mg，于研缽中充分研磨(冰上操作)。

檢測海馬組織內(nèi)SIRT2和乙酰化NF-κB：加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜；將濾膜與5%脫脂奶粉放入塑料袋中，封口，37℃孵育1 h，封閉濾膜，洗膜，分別加入單克隆抗體(1∶400)，4℃過夜，洗膜5 min，換塑料袋加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)，37℃水平搖床孵育1 h，洗膜，化學發(fā)光底物孵育[2]，硝酸纖維素濾膜暗室感光，膠片感光，沖洗膠片。利用凝膠成像分析儀將膠片圖像掃描進計算機，用Bio-Red Quantity One 41.0軟件系統(tǒng)分析圖像，讀取數(shù)據(jù)，以積分灰度值表示?；瘜W發(fā)光劑由NEN Life Science Products，USA公司提供，以β-actin作為內(nèi)參照。

1.5 免疫熒光法檢測小膠質(zhì)細胞活化

將冰凍切片在室溫下風干30 min，用4%的多聚甲醛固定10 min，PBS沖洗3次，每次5 min，然后加入10%的BSA封閉30 min，加入一抗，4℃冰箱中放置過夜，PBS沖洗3次，每次5 min，加入熒光抗體(Alex568，1∶200)，常溫孵育1 h，PBS沖洗3次，每次5 min，加入DAPI染液孵育5 min，PBS沖洗3次，每次5 min，防猝滅劑封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察并獲取圖像。

1.6 ELISA法檢測海馬組織TNF-α和IL-1β水平

取海馬組織，使用ELISA試劑盒檢測海馬組織TNF-α和IL-1β水平，嚴格按說明書操作。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 行為學觀察

在膿毒癥組，懸尾實驗和強迫游泳實驗的結(jié)果均表現(xiàn)為小鼠不動時間明顯增加，糖水偏好實驗的結(jié)果表現(xiàn)為小鼠對糖水的偏好降低；在使用了AGK2后，上述表現(xiàn)更為嚴重(P<0.05，P<0.01)。見圖1。

A：懸尾實驗；B：強迫游泳實驗；C：糖水偏好實驗；①對照組；②膿毒癥組；③干預組；與對照組比較，*P<0.05 **P<0.01；與膿毒癥組比較，#P<0.05 ##P<0.01圖1 SIRT2對膿毒癥小鼠遠期情緒的影響Fig.1 Effect of SIRT2 on long-term depression in mice with sepsis

2.2 SIRT2和乙?；疦F-κB水平的變化

在膿毒癥組，腦組織內(nèi)SIRT2表達水平降低(P<0.05)，AGK2干預可以使腦組織內(nèi)SIRT2表達水平進一步降低(P<0.01)。乙酰化NF-κB的表達水平則相反，LPS使乙酰化NF-κB p65的表達水平增加，AGK2干預將促使其表達水平進一步增加(均P<0.01)。見圖2。

2.3 小膠質(zhì)細胞活化

LPS使腦組織內(nèi)Iba1的表達水平明顯增加，提示小膠質(zhì)細胞活化。AGK2干預促使腦組織內(nèi)Iba1表達水平進一步增加，小膠質(zhì)細胞活化進一步加劇(P<0.05，P<0.01)。見圖3。

①對照組；②膿毒癥組；③干預組；與對照組比較，*P<0.05 **P<0.01；與膿毒癥組比較，##P<0.01圖2 小鼠海馬組織內(nèi)SIRT2及乙?；疦F-κB蛋白表達水平Fig.2 Expression of SIRT2 and acetylated NF-κB protein in hippocampus tissue in mice with sepsis

①對照組；②膿毒癥組；③干預組(右上角，×400)；與對照組比較，**P<0.01；與膿毒癥組比較，#P<0.05 圖3 免疫熒光檢測小鼠海馬組織內(nèi)Iba1的表達(×200)Fig.3 Detection of expression of Iba1 in hippocampus tissue of mice with sepsis by immunofluorescence assay(×200)

2.4 TNF-α和IL-1β水平變化

LPS使腦組織內(nèi)TNF-α和IL-1β水平增加，AGK2干預促使其水平進一步增加(P<0.05，P<0.01)。見圖4。

①對照組；②膿毒癥組；③干預組；與對照組比較，*P<0.05 **P<0.01；與膿毒癥組比較，#P<0.05 ##P<0.01圖4 小鼠海馬組織中TNF-α 及IL-1β的表達水平Fig.4 Expression of TNF-α and IL-1β in hippocampus tissue in mice with sepsis

3 討論

膿毒癥是極具破壞性的全身炎癥反應(yīng)綜合征，可導致多器官功能不全如腎臟、肺臟及肝臟等。大腦也是膿毒癥受累的重要器官，表現(xiàn)為SAE。SAE定義是伴隨膿毒癥出現(xiàn)的彌漫性腦功能障礙，并排除直接顱內(nèi)感染、外傷以及其他腦病如肝性腦病、腎性腦病等。合并SAE的膿毒癥患者死亡率顯著增加，因此，早期診斷及干預對降低相關(guān)的患病率及死亡率有重要的臨床意義。但是，由于SAE缺乏特異性的臨床和生物學標志，其臨床診斷較為困難[4]。

大量動物及臨床研究證據(jù)表明，膿毒癥存活患者數(shù)年后仍有認知、記憶以及情感障礙如抑郁或焦慮表現(xiàn)，并認為海馬組織神經(jīng)元的缺失是記憶缺陷的原因[4]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)：LPS腹腔注射誘導小鼠膿毒癥后，小鼠出現(xiàn)明顯的遠期抑郁表現(xiàn)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導的膿毒癥小鼠海馬組織中小膠質(zhì)細胞激活，炎癥細胞因子TNF-α和IL-1β水平明顯增加。Anderson等[9]研究也表明，LPS誘導的膿毒癥存活小鼠1月后仍表現(xiàn)抑郁和焦慮行為，但并無認知障礙；膿毒癥小鼠腦組織內(nèi)小膠質(zhì)細胞持續(xù)活化，而NF-κB抑制劑可逆轉(zhuǎn)上述表現(xiàn)。目前研究表明，小膠質(zhì)細胞激活及神經(jīng)炎癥反應(yīng)在SAE的發(fā)病中具有重要作用。在SAE中，小膠質(zhì)細胞及星狀細胞激活，釋放炎癥介質(zhì)引起神經(jīng)細胞變性和腦功能障礙[2]。目前，SAE被認為是多因素導致的，如腦灌注與微循環(huán)障礙、血腦屏障障礙、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激以及神經(jīng)遞質(zhì)傳遞異常等，而炎癥反應(yīng)至關(guān)重要[2]。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎癥促進了膿毒癥后的抑郁發(fā)生[8]，但具體的機制并未闡明。

SIRT2是依賴于NAD的組蛋白脫乙酰酶家族成員之一，其在海馬組織含量豐富，參與調(diào)控神經(jīng)炎癥反應(yīng)。研究表明，抑制SIRT2表達對神經(jīng)變性疾病如帕金森病起保護作用，其機制可能是通過抑制小膠質(zhì)細胞激活和炎癥反應(yīng)[10-11]；相反，其他研究表明，抑制SIRT2促進神經(jīng)炎癥反應(yīng)[12-13]。我們研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，膿毒癥小鼠腦組織內(nèi)SIRT2表達水平降低，而小膠質(zhì)細胞激活及炎癥因子TNF-α和IL-1β水平增加；使用SIRT2的特異性抑制劑AGK2后，小膠質(zhì)細胞活化進一步增強，炎癥細胞因子TNF-α和IL-1β水平進一步增加，小鼠的遠期抑郁表現(xiàn)也進一步加重。Pais等[12]研究發(fā)現(xiàn)：LPS刺激腦組織后可以導致腦組織內(nèi)SIRT2水平降低，而SIRT2可以抑制LPS所致的小膠質(zhì)細胞活化，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)。但是，SIRT2抑制小膠質(zhì)細胞活化，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)的作用機制尚不清楚。我們研究還發(fā)現(xiàn)，膿毒癥組SIRT2水平下降，而乙?；疦F-κB p65表達增加；加入AGK2干預后，SIRT2表達進一步降低，而乙?；疦F-κB p65表達顯著增加。據(jù)此推測，抑制SIRT2可促進NF-κB p65乙酰化和激活，從而導致NF-κB下游基因如促炎癥因子等表達增強。其他研究也表明，抑制SIRT2促進小膠質(zhì)細胞激活和NF-κB乙?；?，上調(diào)NF-κB靶基因表達[13]。NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與膿毒癥的病理生理進程[14]。細菌的內(nèi)毒素通過一定途徑使細胞質(zhì)NF-κB活化并迅速發(fā)生核移位，在細胞核中尋找特定靶基因啟動子區(qū)的κB位點并與之結(jié)合，編碼下游各種細胞因子的合成和釋放[15]。由此，我們認為：SIRT2可以通過去乙酰化NF-κB，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，改善遠期抑郁。

本研究闡述了SIRT2在膿毒癥后遠期抑郁發(fā)生中的作用及其機制，為膿毒癥后遠期抑郁發(fā)生的防治提供了新的治療靶點和治療思路。

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(2017-04-05 收稿)

Effect of SIRT2 on Long-term Depression in Mice with Sepsis and Related Mechanism

Zhan Daqian1，Lv Qing2，Chen Huawen1etal

1Department of Emergency Medicine，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China2Department of Pharmacology，School of Basic Medical Sciences，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Objective To investigate the effect of SIRT2 on long-term depression in mice with sepsis and its mechanism.Methods The mice were randomly divided into three groups：control group，sepsis group(injected intraperitoneally with LPS)and intervention group(injected intraperitoneally with AGK2 and LPS).The depressive status of mice was assessed by the tail suspension test，forced swim test and sugar preference test.The expression levels of SIRT2 and acetylated NF-κB protein in hippocampus tissue were detected by Western blotting.The activity of Iba1 in hippocampus tissue was measured by immunofluorescence assay.The levels of TNF-α and IL-1β in hippocampus were measured by ELISA.Results Mice with sepsis showed significant depression-related symptom.The level of SIRT2 in hippocampus tissue was decreased，and the level of acetylated NF-κB p65，the activation of microglia，and the levels of TNF-α and IL-1β in hippocampus tissue were significantly increased(P<0.05，P<0.01).AGK2，selective inhibitor of SIRT2，inhibited the expression of SIRT2 in hippocampus tissue(P<0.01)，and the expression of acetylated NF-κB p65 protein，the activation of microglia and the levels of TNF-α and IL-1β in hippocampus tissue were further increased(P<0.05，P<0.01)，and long-term depression-related symptom was significantly aggravated(P<0.01).Conclusion Reduction of SIRT2 increased the neuroinflammation and depression in mice with sepsis through inhibiting NF-κB deacetylation.

SIRT2； NF-κB； depression； sepsis

*湖北省自然科學基金資助項目(No.2015CFB284)

R515.3

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.011

占大錢，男，1982年生，醫(yī)學博士，主治醫(yī)師,E-mail：zhandaqian117@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：zhuwei@tjh.tjmu.edu.cn