李子希， 盧穎潔， 劉曉峰， 馮曾義， 陳 娟

1華中科技大學同濟醫(yī)學院基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，武漢 430030 2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院檢驗科，武漢 430022 3福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，福州 350005

論 著

利用Gateway技術構建神經(jīng)元特異性人apoE4(1-272)真核表達質(zhì)粒及鑒定*

李子希1,2#， 盧穎潔2#， 劉曉峰1,3， 馮曾義2△， 陳 娟1△

1華中科技大學同濟醫(yī)學院基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系，武漢 4300302華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院檢驗科，武漢 4300223福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，福州 350005

目的 構建神經(jīng)元特異性人apoE4(1-272)片段的真核表達質(zhì)粒，并轉染小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞(N2a細胞)驗證其表達，為后續(xù)利用該質(zhì)粒構建轉基因小鼠，并探討其作用奠定實驗基礎。方法 以同濟醫(yī)學院生物化學與分子生物學系實驗室已有的人apoE4質(zhì)粒為基礎，利用Gateway技術設計引物，將人apoE4(1-272)片段克隆至pRP.EX3d載體上，并將神經(jīng)元特異性啟動子SYN1插入至人apoE4(1-272)片段之前，再借助IRES元件連接EGFP報告基因，構建pRP.EX3d-SYN1-apoE4(1-272)-IRES/EGFP重組表達質(zhì)粒；經(jīng)脂質(zhì)體轉染法將上述質(zhì)粒轉染至N2a細胞，轉染24 h后，熒光顯微鏡觀察轉染效率，并采用Western blot檢測apoE4(1-272)蛋白的表達水平。結果 成功構建神經(jīng)元特異性表達人apoE4(1-272)的真核表達質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定各核心元件序列均正確無誤，與預期結果相一致，且經(jīng)轉染N2a細胞觀察到新構建質(zhì)?？身樌磉_，Western blot檢測結果顯示apoE表達及分子量均與預期一致。結論 成功構建了神經(jīng)元特異性人apoE4(1-272)片段的表達質(zhì)粒，并初步鑒定了其表達功能，為后續(xù)開展相關研究奠定了實驗基礎。

apoE4(1-272)； 神經(jīng)元特異性表達； Gateway技術

人載脂蛋白E4(apolipoprotein E4，apoE4)，是目前公認的阿爾茨海默病(Alzheimer Disease，AD)遺傳易感因子[1]。人apoE蛋白由299個氨基酸組成，分子量約34 kD，主要有3種亞型：apoE2、apoE3、apoE4[2]。在正常生理條件下，腦內(nèi)ApoE主要由星形膠質(zhì)細胞和部分小膠質(zhì)細胞合成，其主要生物學功能是參與體內(nèi)脂質(zhì)代謝，特別是在腦內(nèi)脂質(zhì)轉運和代謝中發(fā)揮著重要作用[3]。近年來的研究表明，神經(jīng)元在應激或受到損傷等刺激時可誘導性表達apoE，且腦內(nèi)神經(jīng)元產(chǎn)生的apoE4比apoE3更易被神經(jīng)元細胞內(nèi)的蛋白酶水解，從而產(chǎn)生多種蛋白裂解片段[4]，其中以apoE4肽鏈羧基端水解產(chǎn)生的含有272個氨基酸殘基的片段[(即apoE4(1-272)片段]最為豐富，且具有較強神經(jīng)毒性，被認為是apoE4引發(fā)AD病變的關鍵病理分子[5]。

Gateway技術是基于λ噬菌體位點特異性重組系統(tǒng)[6]，無需使用限制性內(nèi)切酶和連接酶，經(jīng)BP和LR兩個反應即可將所需的目的基因克隆到各種表達載體上，具有方便、省時、高效的特點[7-8]。本實驗中我們基于實驗室前期已構建的全長apoE4-EGFP質(zhì)粒，采用Gateway技術并結合神經(jīng)元特異性啟動子SYN1(Synapsin Ⅰ)，構建可實現(xiàn)神經(jīng)元特異性表達人apoE4(1-272)片段的重組表達質(zhì)粒，為研究其在ApoE4引發(fā)AD病變中的作用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Gateway? BP ClonaseTMⅡ Enzyme Mix、Gateway? LR ClonaseTMⅡ Plus Enzyme Mix購自Invitrogen公司；膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒均購自TIANGEN公司；Taq DNA聚合酶、dNTP及DNA Ladder購于美國Fermentas公司；小鼠神經(jīng)母細胞瘤(N2a)細胞由同濟醫(yī)學院生物化學與分子生物學系實驗室保存；細胞培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco公司；轉染試劑LipofectamineTM2000購于Invitrogen公司；神經(jīng)元特異性的啟動子SYN1及母載體pRP.EX3d購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司；人apoE多克隆抗體購自美國Biosource公司，內(nèi)參GAPDH抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增attB1-Kozak-ApoE4(1-272)-attB2 以本實驗室已構建的人apoE4-EGFP質(zhì)粒為模板，利用Primer STARTMHS DNA聚合酶，采用根據(jù)Gateway技術要求設計的帶有attB重組位點的針對apoE4(1-272)的上下游引物，并在上游引物起始密碼子之前加入Kozak序列(GCCACC)，在下游引物加入終止密碼子TGA，進行PCR反應。具體擴增程序如下：98℃預變性3 min，98℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)；72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳，通過QIAquick瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒回收目的片段，于-20℃保存。實驗所用引物如下：AttB1-K-ApoE4(1-272)-F，5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGAAGGTT-CTGTGGGCTGC-3′；AttB2-ApoE4(1-272)-R，5′-GCCCCTGGTGGAAGACATGACCCAGCTTTC-TTGTACAAAGTGGTCCCC-3′。

1.2.2 BP反應及陽性克隆鑒定[pDown-apoE4(1-272)] 經(jīng)BP反應獲取含有目的片段的入門克隆，具體BP反應體系如下：上述1.2.1獲得的attB1-K-apoE4(1-272)-attB2 PCR產(chǎn)物100 ng、pDONR221載體100 ng、BP clonase混合物1 μL、采用TE buffer補充至5 μL。25℃，反應1 h。反應結束后，加入0.5 μL蛋白酶K，37℃終止反應10 min。

將上述BP反應產(chǎn)物轉化大腸埃希菌Stbl3，具體操作如下：冰上溶解感受態(tài)細胞；把2 μL的BP反應物加入到Stbl3感受態(tài)細胞中，冰上孵育30 min；42℃熱擊細胞30 s；立即轉移到冰上孵育2 min；加入300 μL培養(yǎng)液在37℃、以225 r/min的轉速搖床孵育1 h，將100 μL轉化物涂到含有50 μg/mL卡拉霉素的LB平板上，37℃過夜。挑取陽性克隆，經(jīng)菌落PCR篩選陽性克隆，并測序鑒定。

1.2.3 LR反應及陽性克隆鑒定[pRP.EX3d-SYN1-apoE4(1-272)-IRES/EGFP] 經(jīng)LR反應將入門克隆轉移到目的載體上，并將SYN1啟動子及EGFP報告基因重組至目的載體，以構建獲得表達克隆，具體LR反應如下：上述1.2.2獲得的入門克隆[pDown-apoE4(1-272)]11.5 ng、pUp-SYN1 10.27 ng、pTail-IRES/EGFP 13.03 ng、母載體pRP.EX3d 31.66 ng、LR clonase酶反應混合液1 μL、TE緩沖液補充至5 μL；25℃，LR反應16 h。反應結束后，加入0.5 μL蛋白酶K，37℃終止反應10 min。轉化LR反應產(chǎn)物到Stbl3，挑取陽性克隆質(zhì)粒，酶切鑒定篩選陽性克隆，并進一步經(jīng)DNA測序鑒定陽性克隆。

1.2.4 細胞培養(yǎng)及轉染野生型小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系(N2a) N2a細胞由本實驗室保存，采用DMEM高糖培養(yǎng)液和Opti-MEM培養(yǎng)液按1∶1混合并加入5%的胎牛血清，于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。隔天更換新鮮培養(yǎng)液，選取對數(shù)生長期的N2a細胞接種至適宜器皿進行實驗。

細胞轉染采用Invitrogen公司無內(nèi)毒素LipofectaminTM2000轉染試劑盒，具體操作參照其操作說明書：轉染前1 d，采用6孔板接種鋪板細胞，第2天，每孔加入2 μg質(zhì)粒DNA，10 μL LipofectamineTM2000轉染試劑，Opti-MEM培養(yǎng)液補充體積至500 μL，輕輕混勻，置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，4～6 h后更換新鮮完全培養(yǎng)液；轉染24 h后熒光顯微鏡下觀察轉染效率，并進行后續(xù)試驗。實驗過程中設立空載體對照和全長apoE4陽性轉染對照。

1.2.5 Western blot檢測apoE4(1-272)蛋白的表達 轉染24 h后，提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取各組蛋白樣品80 μg，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，濕轉到NC膜上，然后用5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(稀釋度：兔抗apoE4單克隆抗體1∶1 000；羊抗GAPDH單克隆抗體1∶5 000)4℃孵育過夜，第2天采用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，并進行后續(xù)的定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 PCR擴增獲得帶有attB重組位點的apoE4(1-272)片段

以本實驗室已有的人全長apoE4-EGFP質(zhì)粒為模板，根據(jù)Gateway技術要求設計帶有attB重組位點，并定向擴增apoE4(1-272)片段的上下游引物(見方法1.2.1部分)，經(jīng)PCR擴增，獲得帶有attB重組位點的apoE4(1-272)片段，以便下一步將其經(jīng)BP反應克隆至帶有attP的pDONR221載體中。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并經(jīng)凝膠回收獲得其目的片段。如圖1所示：目的條帶分子量為882 bp，電泳后所得條帶與其分子量相一致。

2.2 BP反應構建含有apoE4(1-272)片段的入門克隆

以上述2.1獲得的帶有attB重組位點的apoE4(1-272)片段為基礎，經(jīng)BP反應將apoE4(1-272)片段轉移到pDONR221載體上，構建含有目的片段的入門克隆[pDown-ApoE4(1-272)]。隨之將BP反應產(chǎn)物轉化至大腸埃希菌Stbl3，經(jīng)抗性基因卡拉霉素篩選后，挑取陽性克隆，采用載體通用引物M13進行菌落PCR，PCR產(chǎn)物送交測序公司測序驗證，所得結果與數(shù)據(jù)庫比對相一致。

M：DNA Marker;1～5：含有attB序列的apoE4(1-272)PCR產(chǎn)物；PCR產(chǎn)物條帶理論大小為882 bp，與目的條帶大小相符的克隆即為陽性克隆圖1 帶有attB重組位點的apoE4(1-272)片段PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖Fig.1 Agarose electrophoresis of PCR product of apoE4(1-272)with attB sequence

2.3 LR反應構建pRP.EX3d-SYN1-apoE4(1-272)-IRES/EGFP真核表達質(zhì)粒

通過LR反應將神經(jīng)元特異性啟動子(pUp-SYN1)、EGFP報告基因重組體(pTail-IRES/EGFP)轉移到母載體pRP.EX3d，生成SYN1-apoE4(1-272)-IRES/EGFP真核表達克隆，即構建成由神經(jīng)元特異性啟動子SYN1調(diào)控的含有人apoE4(1-272)片段并帶有EGFP熒光標簽的重組質(zhì)粒。將其轉化大腸埃希菌Stbl3，挑選陽性克隆，菌落PCR后進行酶切鑒定，如圖2所示：經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacⅡ酶進行單酶切，單酶切后產(chǎn)生大小為710 bp的目的條帶，與預期理論值大小相一致。初步提示：已成功構建實驗所需目的表達克隆。

M：DNA Marker；1～6：pRP.EX3d-SYN1-apoE4(1-272)-IRES/EGFP的1～6號克隆經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacⅡ進行單酶切鑒定，酶切產(chǎn)物理論大小為710 bp，與目的條帶大小相符的克隆即為陽性克隆圖2 pRP.EX3d-SYN1-apoE4(1-272)-IRES/EGFP表達克隆酶切后凝膠電泳圖Fig.2 Agarose electrophoresis of pRP.EX3d-SYN1-apoE4(1-272)-IRES/EGFP after restriction endonuclease digestion

進一步，送交上述陽性克隆[即最終成功構建的pRP.EX3d-SYN1-apoE4(1-272)-IRES/EGFP真核表達質(zhì)粒]進行測序鑒定，測序結果如圖3所示：表達質(zhì)粒的各組成部分[SYN1、apoE4(1-272)、IRES及EGFP]測序結果均正確無誤，且質(zhì)粒中各部分結構排列完全一致。表明我們已成功構建由神經(jīng)元特異性啟動子SYN1調(diào)控的人apoE4(1-272)重組真核表達質(zhì)粒。

圖3 pRP.EX3d-SYN1-apoE4(1-272)-IRES/EGFP表達質(zhì)粒的測序結果Fig.3 Sequencing results of pRP.EX3d-SYN1-apoE4(1-272)-IRES/EGFP expression plasmid

2.4 pRP.EX3d-SYN1-apoE4(1-272)-IRES/EGFP重組真核表達質(zhì)粒轉染及表達

為了初步驗證我們構建的pRP.EX3d-SYN1-apoE4(1-272)-IRES/EGFP重組真核表達質(zhì)粒的功能，我們將其轉染至N2a細胞中，并設置EGFP空載體對照和全長apoE4陽性對照，轉染24 h后，熒光顯微鏡下觀察各組的轉染效率，隨后收取各組細胞，提取總蛋白，經(jīng)Western blot檢測各組細胞中apoE蛋白的表達情況。如圖4所示：在全長apoE4、我們新構建的apoE4(1-272)片段及EGFP空載體組均有綠色熒光蛋白表達，且進一步的Western blot檢測結果也顯示，全長apoE4和apoE4(1-272)片段組均有apoE蛋白的表達，而空載體對照組未檢測到apoE蛋白的表達，因目的基因與EGFP之間經(jīng)IRES元件連接，因此為非融合蛋白，分子量大小表現(xiàn)為全長apoE4組(34 kD)略大于apoE4(1-272)片段組(27～30 kD)，與理論預期結果相符(圖4)。初步表明：pRP.EX3d-SYN1-apoE4(1-272)-IRES/EGFP重組質(zhì)?？沙晒Ρ磉_于N2a細胞。

3 討論

ApoE4是當前已知的AD最主要的遺傳易感因子，自1993年Rose及其研究團隊首次報道apoE4與AD的發(fā)生密切相關以來，有關apoE4在AD發(fā)生中的作用及機制一直是AD研究領域關注的熱點。近年來的研究發(fā)現(xiàn)：神經(jīng)元在應激或損傷等刺激下，可誘導性表達apoE，且其進一步在胞內(nèi)裂解產(chǎn)生apoE4(1-272)片段[4]。研究顯示：在AD患者以及表達人apoE4的轉基因鼠的腦組織中均存在apoE4(1-272)片段，因而目前認為apoE4(1-272)片段可能是apoE4發(fā)揮促AD作用的關鍵病理分子[9]。有關apoE4(1-272)片段在AD中的作用，引起了不少學者的關注，構建該片段的重組質(zhì)粒，成為在體內(nèi)、體外研究其功能的基礎。但后來的研究發(fā)現(xiàn)，apoE4(1-272)片段具有神經(jīng)毒性效應，作為一個毒性片段，外源性給予apoE4(1-272)片段或過表達該片段可導致培養(yǎng)細胞死亡[10]，為后續(xù)的研究工作帶來了新的挑戰(zhàn)。

圖4 pRP.EX3d-SYN1-apoE4(1-272)-IRES/EGFP在N2a細胞的表達情況(×400)Fig.4 Expression of apoE4(1-272)fragment after being transfected with pRP.EX3d-SYN1-apoE4(1-272)-IRES/EGFP in N2a cells (×400)

基于上述認識，以及apoE4(1-272)片段神經(jīng)元特性表達的特點，我們選用具有神經(jīng)元特異性表達功能，且強啟動子活性適度，主要是在成熟神經(jīng)元表達的SYN1啟動子[11]，構建神經(jīng)元特異性表達人apoE4(1-272)片段的重組質(zhì)粒。這樣一方面既可實現(xiàn)神經(jīng)元特異性表達目的基因[apoE4(1-272)片段]，另一方面也可避免該該片段過度表達引發(fā)的毒性作用，減輕其致細胞死亡的效應。

鑒于實驗室前期研究中已經(jīng)成功構建了帶有EGFP標簽的全長apoE4質(zhì)粒(apoE4-EGFP)，本實驗中我們采用新近發(fā)明的Gateway技術，先擴增獲取apoE4(1-272)片段，再經(jīng)BP和LR兩個反應最終將其轉入目的表達載體中，構建成由SYN1調(diào)控的含有人apoE4(1-272)片段并帶有EGFP熒光標簽的重組質(zhì)粒。結果顯示，相對于傳統(tǒng)的克隆技術，Gateway技術可實現(xiàn)高效、快速、簡捷地將我們需要的目的基因轉移至目標載體上，具有明顯的優(yōu)勢，節(jié)省了實驗的時間、加速了實驗進程。

為了驗證本實驗中我們新構建的pRP.EX3d-SYN1-apoE4(1-272)-IRES/EGFP重組真核表達質(zhì)粒的功能，將其轉染至N2a細胞，觀察其轉染效率、細胞存活情況及其表達效果。實驗結果顯示，新構建的由SYN1調(diào)控的神經(jīng)元特異性表達人apoE4(1-272)的重組質(zhì)粒可順利表達，且未造成培養(yǎng)細胞的大量死亡，熒光顯微鏡下可見EGFP表達發(fā)出的綠色熒光，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)apoE蛋白表達，且相比全長apoE4組，apoE4(1-272)組蛋白條帶分子量略小，與已有文獻報道的apoE4(1-272)片段的分子量大小相符[12]。

可見，本實驗中構建的pRP.EX3d-SYN1-apoE4(1-272)-IRES/EGFP可成功表達人apoE4(1-272)片段，且對細胞毒效應較小，可用于后續(xù)試驗。為我們進一步構建神經(jīng)元特異性表達人apoE4(1-272)片段轉基因小鼠，進而研究其在AD病變中的作用提供了實驗基礎。

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(2017-03-25 收稿)

Construction and Expression of Neuron-specific Recombinant Plasmid of Human ApoE4(1-272) Fragment by Gateway Technique

Li Zixi1,2#，Lu Yingjie2#，Liu Xiaofeng1,3etal

1Department of Biochemistry and Molecular Biology，School of Basic Medical Sciences，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China2Department of Laboratory Medicine，Affiliated Hospital of Chinese and Western Medicine，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China3Department of Laboratory Medicine，the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350005，China

Objective To construct an expression plasmid of neuron-specific human apolipoprotein E4(1-272)fragment，and then identify its function by transfecting into N2a cells，which may provide a foundation for further study.Methods According to the Gateway technique，we designed the primer for apoE4(1-272)fragment，and get apoE4(1-272)fragment by PCR from the apoE4-EGFP plasmid.The apoE4(1-272)fragment was firstly cloned into pDONR221 vector by BP reaction，and then cloned into pRP.EX3d donor by LR reaction，meanwhile the neuron-specific promoter SYN1 was inserted prior to the apoE4(1-272)fragment，and the EGFP was also constructed by ligating the EGFP reporter group with the IRES element.The recombinant plasmid was transfected into N2a cells by LipofectamineTM2000，after 24 h，the transfection efficiency was observed by fluorescence microscopy and the expression level of apoE4(1-272)protein was detected by Western blotting.Results The expression plasmid of neuron-specific human apoE4(1-272)was successfully constructed，and the sequences of the core components were confirmed by sequencing.After being transfected into N2a cells，the newly constructed plasmid was successfully expressed，and the levels and molecular weight of apoE were consistent with the expected by Western blotting.Conclusion In this study，we have successfully constructed a recombinant expression plasmid of neuron-specific human apoE4(1-272)fragment，and identified its expression function in N2a cells，which would facilitate follow-up study for its function.

apoE4(1-272)； neuron-specific expression； Gateway technique

*國家自然科學基金資助項目(No.31171027，No.31670778，No.81371416)；華中科技大學自主創(chuàng)新基金資助項目(No.2016YXMS191)

R542.2

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.001

#共同第一作者，李子希，男，1982年生，醫(yī)學碩士，E-mail：11189847@qq.com；盧穎潔，女，1983年生，醫(yī)學碩士，E-mail：705410418@qq.com

△共同通訊作者，Co-corresponding author，馮曾義，E-mail：982341872@qq.com；陳 娟，E-mail：chenjuanlinda69@163.com