韓連奎，許川，梅宏，孫勇攀，劉波

（貴州省人民醫(yī)院 胸外科，貴州 貴陽(yáng) 550002）

siRNA沉默YKL-40對(duì)支氣管哮喘小鼠氣道平滑肌增殖及遷移的影響*

韓連奎，許川，梅宏，孫勇攀，劉波

（貴州省人民醫(yī)院 胸外科，貴州 貴陽(yáng) 550002）

目的探討小干擾核糖核酸（siRNA）沉默人軟骨糖蛋白39（YKL-40）對(duì)支氣管哮喘小鼠氣道平滑肌增殖及遷移的影響。方法20只健康雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為健康組（n=10）和哮喘組（n=10），采取腹腔注射抗原和霧化吸入卵蛋的方式復(fù)制哮喘模型，健康組小鼠處理與哮喘組相同，只是將致敏物換成生理鹽水，留取氣管和支氣管進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，兩組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同分為siRNA-YKL-40組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，MTT法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞增殖情況，Transwell法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞遷移能力，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞中YKL-40、白細(xì)胞介素4（IL-4）和干擾素-γ（IFN-γ）基因和蛋白表達(dá)。結(jié)果哮喘組中siRNA-YKL-40組48～96h時(shí)細(xì)胞吸光度A值均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，哮喘組中siRNA-YKL-40組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組48～96 h時(shí)細(xì)胞吸光度A值均高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；哮喘組中siRNA-YKL-40組遷移細(xì)胞數(shù)（86.38±8.61）個(gè)，低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，哮喘組遷移細(xì)胞數(shù)均高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；哮喘組和健康組中siRNA-YKL-40組YKL-40基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.05），哮喘組中siRNA-YKL-40組IL-4基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，而IFN-γ基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量與IFN-γ/IL-4均高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P＜0.05），與健康組比較，哮喘組中siRNA-YKL-40組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組IL-4基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，而IFN-γ基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量和IFN-γ/IL-4均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論靶向YKL-40基因沉默能抑制氣道壁平滑肌細(xì)胞增殖及遷移，可能與調(diào)節(jié)IL-4/IFN-γ失衡狀態(tài)而減少氣道炎癥反應(yīng)有關(guān)。

支氣管哮喘；人軟骨糖蛋白39；沉默核糖核酸；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

支氣管哮喘作為氣道慢性炎癥性疾病，近年來(lái)，隨著生活環(huán)境不斷惡化，其發(fā)病率呈逐漸升高趨勢(shì)[1]，發(fā)病急，且多在夜間或凌晨發(fā)病，出現(xiàn)氣促、咳嗽、喘息及胸悶等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可危及患者生命[2]。研究表明[3]，慢性炎癥所致氣道重塑是支氣管哮喘的重要病理特征之一。而氣道平滑肌細(xì)胞增殖及肥大在氣道重塑中處于中心地位，因而，氣道平滑肌逐漸成為哮喘治療的靶位[4]。YKL-40又稱人軟骨糖蛋白39（human cartilage glycoprotein-39，HCgp39），是存在于人體內(nèi)的甲殼酶樣蛋白，參與調(diào)控炎癥反應(yīng)、組織重構(gòu)、纖維化及腫瘤發(fā)生[5]。研究表明[6]，哮喘急性發(fā)作期氣道和血清中YKL-40水平升高。但具體作用機(jī)制尚不明確。本研究擬采用小干擾核糖核酸（small interfering ribonucleic acid，siRNA）靶向沉默YKL-40，觀察其對(duì)氣道平滑肌增殖及遷移的影響，以期為支氣管哮喘機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設(shè)備

胎牛血清（購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司），DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(lán)（tetramethylazo blue，MTT）及二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（購(gòu)自美國(guó)Gibco公司），DMEM培養(yǎng)基及Trizol總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（均購(gòu)自遼寧省大連寶生物有限公司），YKL-40及內(nèi)參引物、干擾序列和陰性序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，METAFECTENE PRO轉(zhuǎn)染試劑（購(gòu)自德國(guó)Biontex公司），免疫組織化學(xué)染色試劑盒（購(gòu)自北京中杉金橋生物公司），MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自北京碧云天生物公司），兔抗人YKL-40多克隆抗體（購(gòu)自美國(guó)Quidel公司），白細(xì)胞介素4（interleukin 4，IL-4）抗體（購(gòu)自上海博升生物公司），干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）抗體（購(gòu)自上海瑞齊生物有限公司），Transwell小室（購(gòu)自美國(guó)Corning Costar公司），酶標(biāo)分析儀（購(gòu)自美國(guó)Bio-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)制小鼠哮喘模型20只健康雌性BALB/c小鼠購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，4～6周齡，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下，自由飲水、進(jìn)食，利用隨機(jī)數(shù)字表將小鼠隨機(jī)分為健康組和哮喘組，哮喘組參考文獻(xiàn)[7]中的方法復(fù)制小鼠哮喘模型：第1天將0.2ml抗原溶液（10%卵蛋+10%氫氧化鋁）腹腔注射致敏，14 d后，采取超聲霧化的方式吸入2.5%的卵蛋約40min以誘發(fā)哮喘，復(fù)制成功標(biāo)志是小鼠出現(xiàn)嗆咳、煩躁、輕度發(fā)紺和呼吸加快等哮喘發(fā)作表現(xiàn)，間隔1d，再次誘發(fā)，連續(xù)進(jìn)行6周。健康組小鼠處理與哮喘組相同，只是將致敏物換成生理鹽水。兩組小鼠均于最后1次霧化吸入后24 h時(shí)，采取脫頸處死，留取氣管和支氣管進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，取左肺中葉進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-euphorbia，HE）染色觀察，其余肺組織利用組織鐵塊法分別對(duì)兩組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)5代。

1.2.2 小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 兩組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同進(jìn)行分組：siRNA-YKL-40組[轉(zhuǎn)染siRNA-YKL-40序列，正向引物：5'-CAAUGUAAGACUCGGGAUUUU-3'；反向引物：5'-（P）AAUCCCGAGUCUUACAUUGUU-3']；陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染siRNA-NC：5'-UGGUUUACAUGUCG ACUAA-3'）和空白對(duì)照組（只加入磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）。將小鼠氣道壁平滑肌細(xì)接種于6孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/孔，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，換成不含血清DMEM溶液，過(guò)夜培養(yǎng)，按照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞增殖情況 取轉(zhuǎn)染后各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的氣道壁平滑肌細(xì)胞，接種于96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103個(gè)/孔，分別于培養(yǎng)48、72和96 h時(shí)，加入MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，加入DMSO，室溫下振蕩15min混勻。用酶標(biāo)分析儀取570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度A值。

1.2.4 Transwell法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞遷移能力 取轉(zhuǎn)染后各組培養(yǎng)48 h的氣道壁平滑肌細(xì)胞，接種于24孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/孔，Transwell小室下室中加入含10%胎牛血清的DMEM液，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，取出小室，輕輕去除小室上室培養(yǎng)基，甲醛固定6min，結(jié)晶紫染色8min，利用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞中YKL-40、IL-4和IFN-γ基因表達(dá) 取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解后，用Trizol總RNA提取試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行提取，用紫外分光光度計(jì)對(duì)總RNA純度進(jìn)行檢測(cè)，取A280/A260≥1.80作為合格樣品。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為模板單鏈互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA），以cDNA為模板進(jìn)行PCR?；蛐蛄小KL-40正向引物：5'-CCTGCTCAGCGCAGCACTGT-3'，反向引物：5'-GCT TTTGACGCTTTCCTGGTC-3'；IL-4正向引物：5'-AG CAGTTCCACAGGCACAAG-3'，反向引物：5'-CTGGG TGGCTTCCTTCACAG-3'；IFN-γ正向引物：5'-AGA GGATGGTTTGCATCTGGGTCA-3'；反向引物：5'-AC AACGCTATGCAGCTTGTTCGTG-3'。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH），正向引物：5'-ACCACAGTCCATGCCATCA C-3'，反向引物：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1min，92℃變性45 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，連續(xù)進(jìn)行40次循環(huán)，每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-△△Ct法獲得不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞中YKL-40、IL-4和IFN-γ相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞中YKL-40、IL-4和IFN-γ蛋白表達(dá)取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解后，利用總蛋白提取試劑盒對(duì)總蛋白進(jìn)行提取，利用總蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)純度，加熱變性。取30 μg蛋白，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行電泳，電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜，用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉2h，緩沖鹽溶液沖洗，分別加入一抗YKL-40多克隆抗體、IL-4抗體和IFN-γ抗體（稀釋比分別為1∶200、1∶500和1∶800），4℃過(guò)夜孵育，加入二抗，室溫下孵育45min，TBST沖洗5次，用電化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行發(fā)光顯影，拍照并用Quantity One軟件進(jìn)行分析，對(duì)細(xì)胞中YKL-40、IL-4和IFN-γ蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠哮喘模型鑒定

哮喘組小鼠在復(fù)制過(guò)程中均出現(xiàn)煩躁、呼吸急促、嗆咳、四肢震顫、活動(dòng)減少及抓撓等表現(xiàn)，隨著致敏時(shí)間推移，嚴(yán)重的小鼠出現(xiàn)輕度口鼻發(fā)紺、點(diǎn)頭呼吸及反應(yīng)遲鈍表現(xiàn)；健康組小鼠則在整個(gè)復(fù)制過(guò)程中未出現(xiàn)異常表現(xiàn)，呼吸、進(jìn)食及行為正常。對(duì)兩組小鼠肺組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色觀察，哮喘組小鼠氣道上皮造破壞，支氣管周圍出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，平滑肌細(xì)胞層出現(xiàn)增厚；健康組小鼠氣道上皮完整，支氣管周圍未見(jiàn)炎癥細(xì)胞，平滑肌正常。見(jiàn)圖1。

2.2 不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞增殖情況比較

哮喘組中siRNA-YKL-40組48～96 h時(shí)細(xì)胞吸光度A值均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.944、5.182和11.839，P=0.000、0.012和0.000）；哮喘組中siRNA-YKL-40組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組48～96 h時(shí)細(xì)胞吸光度A值均高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.362、12.918、10.148、7.056、7.901、7.906、3.389、6.327和7.828，均P=0.000）。見(jiàn)表1。

2.3 不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞遷移能力比較

圖1 小鼠肺組織病理學(xué)改變 （免疫組織化學(xué)×100）

哮喘組中 siRNA-YKL-40組遷移細(xì)胞數(shù)（86.38±8.61）個(gè)，低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，分別為（179.64±11.32）和（176.51±9.26）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=288.926，P＜0.05）；健康組中siRNAYKL-40組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)分別為（61.35±4.98）、（65.68±6.42）和（63.42±5.71）個(gè)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.180，P=0.53）；哮喘組遷移細(xì)胞數(shù)均高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.827、29.676、45.165，均P=0.000）。見(jiàn)圖2、3。

2.4 不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞中YKL-40、IL-4和IFN-γ基因表達(dá)

哮喘組和健康組中siRNA-YKL-40組YKL-40信使RNA（messenger RNA，mRNA）相對(duì)表達(dá)量均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.019和 798.315，均 P=0.000）；哮喘組中siRNA-YKL-40組IL-4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，而IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量和IFN-γ/IL-4均高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.769、3.456及9.933，P=0.000、0.046及0.001）；與健康組比較，哮喘組中siRNA-YKL-40組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組IL-4mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，而IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量和IFN-γ/IL-4均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.419、33.695、47.787、23.115、16.665、31.470、11.699、24.122和66.060，均P=0.000）。見(jiàn)表2。

表1 不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞增殖情況比較（A值±s）

表1 不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞增殖情況比較（A值±s）

注：1）與同組空白對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與同組陰性對(duì)照組比較，P＜0.05；3）與健康組相應(yīng)亞組比較，P＜0.05

組別48 h72 h96 h哮喘組siRNA-YKL-40組 0.31±0.061）2）3）0.49±0.081）2）3）0.56±0.101）2）3）陰性對(duì)照組 0.49±0.073）0.63±0.093）0.78±0.123）空白對(duì)照組 0.51±0.083）0.65±0.113）0.79±0.113）健康組siRNA-YKL-40組 0.21±0.04 0.31±0.06 0.42±0.06陰性對(duì)照組 0.23±0.05 0.33±0.07 0.44±0.05空白對(duì)照組 0.24±0.06 0.32±0.05 0.43±0.08

圖2 哮喘組中不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞遷移細(xì)胞比較

圖3 健康組中不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞遷移細(xì)胞比較

2.5 不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞中YKL-40、IL-4和IFN-γ蛋白表達(dá)

哮喘組和健康組中siRNA-YKL-40組YKL-40蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.386、9.481，P＜0.05）；哮喘組中siRNA-YKL-40組IL-4蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，而IFN-γ蛋白相對(duì)表達(dá)量和IFN-γ/IL-4均高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.810、3.990和12.283，P＜0.05）；與健康組比較，哮喘組中siRNA-YKL-40組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組IL-4蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，而IFN-γ蛋白相對(duì)表達(dá)量和IFN-γ/IL-4均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.115、4.874、19.059、11.490、4.890、13.474、11.886、3.266和10.634，P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.002和0.000）。見(jiàn)表3和圖4、5。

表2 不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞中YKL-40、IL-4及IFN-γ基因表達(dá) （±s）

表2 不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞中YKL-40、IL-4及IFN-γ基因表達(dá) （±s）

注：1）與同組空白對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與同組陰性對(duì)照組比較，P＜0.05；3）與健康組相應(yīng)亞組比較，P＜0.05

組別YKL-40 mRNAIL-4 mRNAIFN-γmRNAIFN-γ/IL-4哮喘組siRNA-YKL-40組 1.72±0.121）2）3）1.57±0.131）2）3）0.49±0.071）2）3）0.31±0.091）2）3）陰性對(duì)照組 2.16±0.153）1.97±0.113）0.39±0.093）0.20±0.043）空白對(duì)照組 2.19±0.173）1.99±0.143）0.41±0.083）0.21±0.053）健康組siRNA-YKL-40組 0.31±0.091）2）0.34±0.111）2）1.58±0.081）2）1.38±0.051）2）陰性對(duì)照組 1.02±0.05 0.98±0.03 0.99±0.04 1.03±0.05空白對(duì)照組 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00

表3 不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞中YKL-40、IL-4及IFN-γ蛋白表達(dá) （±s）

表3 不同轉(zhuǎn)染組小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞中YKL-40、IL-4及IFN-γ蛋白表達(dá) （±s）

注：1）與同組空白對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與同組陰性對(duì)照組比較，P＜0.05；3）與健康組相應(yīng)亞組比較，P＜0.05

組別YKL-40蛋白IL-4蛋白IFN-γ蛋白IFN-γ/IL-4哮喘組siRNA-YKL-40組 0.63±0.071）2）3）0.65±0.071）2）3）0.24±0.051）2）3）0.37±0.061）2）3）陰性對(duì)照組 0.81±0.093）0.72±0.083）0.16±0.043）0.22±0.073）空白對(duì)照組 0.83±0.103）0.71±0.063）0.17±0.063）0.24±0.093）健康組siRNA-YKL-40組 0.42±0.051）2）0.35±0.071）2）0.33±0.051）2）0.87±0.071）2）陰性對(duì)照組 0.53±0.07 0.45±0.06 0.26±0.04 0.58±0.06空白對(duì)照組 0.52±0.06 0.44±0.04 0.27±0.03 0.61±0.08

圖4 哮喘組中不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中YKL-40、IL-4和IFN-γ蛋白表達(dá)

圖5 健康組中不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中YKL-40、IL-4和IFN-γ蛋白表達(dá)

3 討論

哮喘作為最為常見(jiàn)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，病情遷延反復(fù)，嚴(yán)重影響人類健康。該病以氣道慢性炎癥及氣道高反應(yīng)性為特征，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，多種炎癥因子和炎癥細(xì)胞均參與哮喘發(fā)病過(guò)程，Th1/Th2平衡失調(diào)被認(rèn)為在哮喘病程中發(fā)揮重要作用[8]。YKL-40是一種殼質(zhì)酶的衍生物，在組織纖維化、促進(jìn)炎癥反應(yīng)、組織重塑、細(xì)胞增殖及凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9]。研究表明[10]，哮喘患者急性發(fā)作時(shí)血漿YKL-40水平升高，且與哮喘嚴(yán)重程度及氣道重構(gòu)等密切相關(guān)。

本研究顯示，通過(guò)腹腔注射致敏及霧化吸入誘導(dǎo)的方式可使小鼠出現(xiàn)哮喘表現(xiàn)，免疫組織化學(xué)染色顯示，哮喘組小鼠氣道上皮造破壞，支氣管周圍出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，平滑肌細(xì)胞層出現(xiàn)增厚，提示成功復(fù)制小鼠哮喘模型。研究表明[11]，支氣管上皮細(xì)胞體量增加，異常增殖及向表皮層遷移聚集在哮喘病程中發(fā)揮重要作用。本研究顯示，哮喘組中siRNAYKL-40組48～96 h時(shí)細(xì)胞吸光度A值均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，哮喘組中siRNA-YKL-40組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組48～96 h時(shí)細(xì)胞吸光度A值均高于健康組，說(shuō)明哮喘小鼠氣道平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖，而特異性抑制YKL-40表達(dá)，可抑制氣道平滑肌細(xì)胞增殖。本研究還顯示，哮喘組中siRNAYKL-40組siRNA-YKL-40組遷移細(xì)胞數(shù)低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，哮喘組遷移細(xì)胞數(shù)均高于健康組，說(shuō)明哮喘小鼠氣道平滑肌細(xì)胞異常遷移在哮喘發(fā)病中發(fā)揮重要作用，而抑制YKL-40基因則可減少細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)，進(jìn)一步提示YKL-40參與哮喘發(fā)病過(guò)程可能通過(guò)調(diào)節(jié)氣道平滑肌細(xì)胞增殖及遷移而直接參與氣道重構(gòu)，與肖琳等[12]研究結(jié)論相似。

研究表明[13]，慢性炎癥反應(yīng)及大量釋放的炎癥介質(zhì)與氣道重塑密切相關(guān)。有研究指出[14]，YKL-40在Th2誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子釋放及組織重構(gòu)中發(fā)揮重要作用，YKL-40可促進(jìn)Th2分化及增加Th2數(shù)量。而Th1/Th2平衡失調(diào)在哮喘發(fā)病中發(fā)揮重要作用[15]。研究表明[16]，Th細(xì)胞所處局部環(huán)境中的細(xì)胞因子在Th1/Th2極化中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，其中，Ⅰ型細(xì)胞因子，如IFN-γ可促進(jìn)向Th1分化，而Ⅱ型細(xì)胞因子，如IL-4，則促進(jìn)向Th2分化。本研究顯示，哮喘組中siRNA-YKL-40組IL-4基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，而IFN-γ基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量和IFN-γ/IL-4均高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，與健康組比較，哮喘組中siRNA-YKL-40組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組IL-4基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，而IFN-γ基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量和IFN-γ/IL-4均降低，說(shuō)明哮喘小鼠氣道壁平滑肌細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ出現(xiàn)表達(dá)異常，破壞Th1/Th2平衡，從而誘導(dǎo)氣道慢性炎癥反應(yīng)及氣道重構(gòu)，而特異性抑制YKL-40表達(dá)，則可減少IL-4表達(dá)，促進(jìn)IFN-γ表達(dá)，使IFN-γ/IL-4比值接近正常，從而糾正Th1/Th2平衡，提示YKL-40可能通過(guò)調(diào)節(jié)IL-4/IFN-γ失衡狀態(tài)而實(shí)現(xiàn)對(duì)炎癥反應(yīng)及氣道重構(gòu)的影響。本研究亦顯示，在抑制正常氣道壁平滑肌細(xì)胞中YKL-40表達(dá)后，IFN-γ/ IL-4平衡未被打破，筆者推測(cè)可能正常氣道壁平滑肌細(xì)胞具有一定的自我調(diào)節(jié)及修復(fù)過(guò)程，在一定范圍內(nèi)可維持IFN-γ/IL-4平衡。

綜上所述，特異性抑制YKL-40表達(dá)可抑制氣道壁平滑肌細(xì)胞增殖及遷移，可能與調(diào)節(jié)IL-4/IFN-γ失衡狀態(tài)而減少氣道炎癥反應(yīng)有關(guān)，但具體調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步研究明確。

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Effect of silencingYKL-40by siRNA on proliferation and migration of airway smooth muscle cells in asthmatic mice*

Lian-kui Han,Chuan Xu,Hong Mei,Yong-pan Sun,Bo Liu
(Department of Thoracic Surgery,Guizhou Provincial People's Hospital, Guiyang,Guizhou 550002,China)

ObjectiveTo investigate the effects of silencing human cartilage glycoprotein-39(YKL-40)by small interfering ribonucleic acid (siRNA)on the proliferation and migration of airway smooth muscle cells in asthmatic mice.MethodsTwenty healthy female BALB/c mice were randomly divided into healthy group (n=10)and asthma group (n=10).Asthma models were established by intraperitoneal injection of antigens and inhalation of ovum (OVA).The mice in the healthy group were treated the same as the asthma group,except that the sensitizers were replaced by saline.Tracheal and bronchial tubes were used for cell culture.According to the different transfectants,the airway smooth muscle cells of the two groups were divided into siRNA-YKL-40 group,negative control group and blank control group.The proliferation of airway smooth muscle cells of mice in different transfected groups were detected by MTT assay.The migration abilities of airway smooth muscle cells of mice in different transfected groups were detected by Transwell assay.The expressions ofYKL-40,interleukin 4 (IL-4)and interferon-γ (IFN-γ)genes and proteins in airway smooth muscle cells in different transfected groups were detected by qRT-PCR and Western blot,respectively.ResultsIn the asthma group,the absorbance A values at 48,72 and 96 h of the siRNA-YKL-40 group were significantly lower than the negative control group and blank control group and the absorbance A values at 48,72 and 96 h of the siRNA-YKL-40 group,negative control group and blank control group in the asthma group were significantly higher than the healthy group, (P＜0.05).In the asthma group,the number of migrated cells of the siRNA-YKL-40 group was (86.38±8.61),which was significantly lower than the negative control group and blank control group and the number of migrating cells of the asthma group was significantly higher than the healthy group(P＜0.05).In the asthma group and the healthy group,the relative expression levels ofYKL-40gene and protein in the siRNA-YKL-40 group were lower than the negative control group and blank control group (P＜0.05),in the asthma group,the relative expression levels ofIL-4 gene and protein in the siRNA-YKL-40 group were lower than the negative control group and blank control group,while the relative expression levels ofIFN-γgene and protein and the value of IFN-γ/IL-4 were significantly higher than the negative control group and blank control group (P＜0.05).Compared with the healthy group,the relative expression levels ofIL-4gene and protein in the siRNA-YKL-40 group,negative control group and blank control group in the asthmatic group were significantly increased,while the relative expression levels ofIFN-γ gene and protein and the value of IFN-γ/IL-4 were significantly decreased (P＜0.05).ConclusionsGene silencing targeting YKL-40 inhibits airway smooth muscle cell proliferation and migration.It might be related to the regulation of the imbalance of IL-4/IFN-γ to reduce airway inflammation.

bronchial asthma;human cartilage glycoprotein-39;RNA silencing;cell proliferation;cell migration

R562.25

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.18.003

1005-8982（2017）18-0015-07

2017-01-11

貴州省科技計(jì)劃（黔科合SY字，No：20123101）

許川，E-mail：3219475665@qq.com；Tel：15985156446