劉芳，蘇堅(jiān)，曾穎，夏紅，蘇波，凌暉，曾希，蘇琦

[1.南華大學(xué)腫瘤研究所（湖南省胃癌研究中心 湖南省高校腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 病理科，湖南 衡陽(yáng) 421001]

二烯丙基二硫在RORα抑制人胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用*

劉芳1，蘇堅(jiān)2，曾穎1，夏紅1，蘇波1，凌暉1，曾希1，蘇琦1

[1.南華大學(xué)腫瘤研究所（湖南省胃癌研究中心 湖南省高校腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 病理科，湖南 衡陽(yáng) 421001]

目的探討二烯丙基二硫（DADS）是否上調(diào)維甲酸相關(guān)孤核受體α（RORα）抑制人胃癌細(xì)胞株MGC803細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。方法相差顯微鏡觀察MGC803細(xì)胞形態(tài)的改變。逆轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR）、蛋白免疫印跡法（Western blot）、免疫熒光與免疫組織化學(xué)檢測(cè)EMT的相關(guān)分子表達(dá)。裸鼠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DADS與沉默RORα對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的影響。結(jié)果相差顯微鏡顯示，沉默RORα細(xì)胞較MGC803細(xì)胞大小與形狀差異更明顯。DADS作用后，細(xì)胞大小較一致，呈圓形或橢圓形，梭形細(xì)胞減少，異型性下降。RT-PCR與Western blot顯示，DADS處理后較處理前各組RORα mRNA與蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。DADS作用對(duì)照組與空載體組較沉默組效果更為明顯（P＜0.05）。RORα沉默較對(duì)照組和空載體組細(xì)胞鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Snail）和波形蛋白（Vimentin）mRNA與蛋白表達(dá)上調(diào)，而E-鈣黏蛋白（E-cadherin）mRNA與蛋白下調(diào)（P＜0.05）。DADS處理后，各組Snail蛋白下調(diào)、Vimentin mRNA與蛋白下調(diào)和E-cadherin mRNA與蛋白上調(diào)（P＜0.05）。免疫熒光顯示，沉默組細(xì)胞Snail與Vimentin陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)，而E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)減弱。DADS作用后，結(jié)果相反。裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示，RORα沉默組移植瘤較對(duì)照組生長(zhǎng)加快和體重增加（P＜0.05），增殖細(xì)胞核抗原（Ki-67）、Snail、CD34及Vimentin陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組增加，而E-cadherin陽(yáng)性降低。DADS處理各組移植瘤生長(zhǎng)與體積減慢與減小，Ki-67、Snail、CD34與Vimentin陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組減弱，而E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論DADS通過(guò)上調(diào)RORα可體內(nèi)外抑制人胃癌MGC803細(xì)胞EMT。

二烯丙基二硫；維甲酸相關(guān)孤核受體α；人胃癌MGC803細(xì)胞；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

胃癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生率與死亡率居第2位。由于患者就診時(shí)大多已發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，療效不佳，5年生存率＜10%[1-2]。因此，篩選有效藥物和尋找治療靶點(diǎn)對(duì)防治胃癌具有重要的意義。二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS）是大蒜中的一種脂溶性的有效成分，對(duì)多種腫瘤均有抑制作用，是一種具有開發(fā)潛力的抗腫瘤藥物[3]。筆者發(fā)現(xiàn)，DADS處理人胃癌MGC803細(xì)胞后，維甲酸相關(guān)孤核受體α（retinoid acid receptor related orphan receptor α,RORα）蛋白上調(diào)[4]。目前認(rèn)為，RORα是候選抑癌基因，在腫瘤表達(dá)下調(diào)，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，可能是腫瘤治療的靶點(diǎn)[5-6]。RORα在胃癌中低表達(dá)，與胃癌發(fā)生和分化程度有關(guān)[7]。本研究進(jìn)一步探討DADS上調(diào)RORα表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌MGC803細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，RORα沉默MGC803細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[8]，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5%二氧化碳CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑

DADS（購(gòu)自美國(guó)Fluka公司），RNA提取試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Omega公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Promega公司），E-cadherin、Vimentin與βactin抗體（購(gòu)自英國(guó)Abcam公司），Snail、Ki-67與CD34等抗體及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司），胎牛血清（購(gòu)自浙江省杭州四季青生物工程公司），引物經(jīng)Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生物工程（股份）有限公司合成。羊抗兔IgG-HR和羊抗小鼠IgG-HRP（購(gòu)自江蘇省南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），羊抗小鼠IgG（H+L）（購(gòu)自美國(guó)Protech生物公司），熒光染料DAPI和正常山羊血清（購(gòu)自湖北省博士德生物公司），Max VisionTM試劑盒（購(gòu)自福建省福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）。

1.3 相差顯微鏡觀察

人胃癌MGC803細(xì)胞與RORα沉默MGC803細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，倒置相差顯微鏡觀察DADS處理前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）分析

總RNA提取試劑盒（Total RNA Kit）提取細(xì)胞總RNA，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計(jì)并合成PCR引物序列。RORα正向引物：5'-G TCAGCAGCTTCTACCTGGAC-3'；反向引物：5'-CAG TTGGGGAAGTCTCGCCG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度151 bp。Vimentin正向引物：5'-ACACCCTGCAATCTTTCAGAC A-3'；反向引物：5'-AGAAATCCTGCTCTCCTCGCCT-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度635 bp。E-cadherin正向引物：5'-CTC CCAATACATCTCCCTTCAC-3'；反向引物：5'-CGCC TCCTTCTTCATCATAGTAA-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度423 bp。β-actin正向引物：5'-TCTACAATGAGCTGCGTGTG G-3'；反向引物：5'-GGAACCGCTCATTGCCAATG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度498bp。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，（RORα、Vimentin和E-cadherin退火溫度分別為：53℃、52℃和54℃）45 s退火，72℃延伸80 s，28個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10min。5μl的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳，溴化乙啶染色，IS1000圖像分析軟件讀取灰度值，相對(duì)值以目的基因與βactin灰度值之比表示。

1.5 Western blot檢測(cè)

收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每組取等量樣本進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉1h，加一抗，4℃過(guò)夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖溶洗膜，加二抗孵育1h，洗膜，ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。

1.6 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)

先在6孔板中滴加培養(yǎng)基，然后將消毒的蓋玻片放入6孔板。將對(duì)數(shù)期的MGC803細(xì)胞制成懸液，每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁融合至80%時(shí)，棄舊培養(yǎng)基。取出蓋玻片，PBS洗5min×3，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，常溫下靜置15min，PBS洗5min×3；將0.5%Triton覆蓋細(xì)胞后，常溫下靜置30min，后用PBS洗5min×3，吸干凈殘存PBS液；山羊血清封閉，37℃孵育1h；濾紙吸凈封閉液，加入一抗，濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜；第2天移置37℃復(fù)溫1h，PBS洗5min×3次；在暗室中加異硫氰酸熒光素的二抗，37℃避光濕盒中孵育1h，PBS洗5min×3。染核：將0.4 μg/μl的DAPI覆蓋細(xì)胞，常溫下避光靜置2～5min，PBS洗5min×3，甘油封片在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

裸鼠（購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），4周齡，雄性，分為MGC803細(xì)胞組（對(duì)照組）、（MGC803+DADS）組、RORα沉默組和（RORα沉默+DADS）組，每組5只。將各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞密度調(diào)至1×107個(gè)/ml，分別取0.2ml細(xì)胞懸液接種于裸鼠腋下。觀察接種后裸鼠進(jìn)食、飲水、毛發(fā)、精神及活動(dòng)等情況。每隔7d測(cè)量移植瘤大小（長(zhǎng)徑和短徑），腫瘤體積：V=a×b2/2。移植瘤組織固定于10%的中性甲醛。

1.8 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)

采用MaxVisionTM法，分別滴加一抗室溫60min，4℃過(guò)夜，PBS洗3min×3，滴加即用型Max VisionTM試劑，室溫下15min，PBS洗5min×3。二氨基聯(lián)苯胺顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封固及鏡檢。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均值比較用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析或單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DADS與沉默RORα對(duì)MGC803細(xì)胞RORα表達(dá)的影響

RT-PCR與Western blot顯示，RORα沉默組較對(duì)照組MGC803細(xì)胞RORα mRNA（F=1 885.149，P=0.000）與蛋白表達(dá)下調(diào)（F=190.822，P=0.000）。DADS處理后較處理前各組RORα mRNA（F=1 885.149，P=0.000）與蛋白表達(dá)上調(diào)（F=190.822，P=0.000）。見圖1。

2.2 DADS與沉默RORα對(duì)MGC803細(xì)胞形態(tài)與EMT相關(guān)分子的影響

相差顯微鏡顯示，MGC803細(xì)胞大小不一，大部分呈長(zhǎng)梭形，纖維母細(xì)胞樣，細(xì)胞膜可見突起，核漿比值增大，異型性明顯。RORα沉默細(xì)胞較MGC803細(xì)胞大小與形狀差異更明顯，纖維母細(xì)胞樣梭形細(xì)胞增多，異型性更為明顯。DADS作用后，對(duì)照組與沉默組較處理前細(xì)胞大小一致，大部分呈圓形或橢圓形，核漿比值下降，異型性降低（見圖2）。表明DADS可上調(diào)RORα抑制MGC803細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

RT-PCR與 Western blot顯示，RORα 沉默MGC803細(xì)胞較對(duì)照組的Snail蛋白表達(dá)上調(diào)（F=545.652，P=0.000）。并且沉默RORα可上調(diào)Vimentin和下調(diào)E-cadherin mRNA（F=1 250.268和67.561，P=0.000和0.016）與蛋白表達(dá)（F=155.246和35.624，P=0.000）。DADS處理后，各組Snail蛋白（F=545.652，P=0.000）、Vimentin mRNA（F=1 250.268，P=0.000）與蛋白明顯下調(diào)（F=155.246，P=0.000）和E-cadherin mRNA（F=67.561，P=0.000）與蛋白上調(diào)（F=35.624，P=0.000）。表明DADS通過(guò)上調(diào)RORα下調(diào)Snail與Vimentin和上調(diào)E-cadherin抑制MGC803細(xì)胞EMT。見圖3～5。

圖1DADS與沉默RORα對(duì)RORα表達(dá)的影響

圖2DADS與沉默RORα對(duì)MGC803細(xì)胞形態(tài)的影響（×40）

2.3 DADS與沉默RORα對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

免疫熒光檢測(cè)顯示，Snail蛋白定位胞核，Vimentin與E-cadherin蛋白主要定位胞漿。RORα沉默組細(xì)胞Snail與Vimentin陽(yáng)性信號(hào)較對(duì)照組增強(qiáng)，而E-cadherin陽(yáng)性信號(hào)減弱，然而，DADS作用后，Snail與Vimentin陽(yáng)性信號(hào)較對(duì)照組降低，而E-cadherin陽(yáng)性升高，與Western blot檢測(cè)結(jié)果一致。見圖6。

2.4 DADS與沉默RORα對(duì)MGC803細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

圖3DADS與沉默RORα對(duì)MGC803細(xì)胞Snail蛋白表達(dá)的影響

圖4DADS與沉默RORα對(duì)MGC803細(xì)胞Vimentin表達(dá)的影響

圖5 DADS與沉默RORα對(duì)MGC803細(xì)胞E-cadherin表達(dá)的影響

采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果顯示：①各組組內(nèi)裸鼠移植瘤體積隨著時(shí)間延長(zhǎng)，腫瘤體積變大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=69.921，P=0.000）。②各組與對(duì)照組比較生長(zhǎng)變慢瘤體變小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=90.148，P=0.000），miR-RORα與對(duì)照組比較生長(zhǎng)加快瘤體變大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=72.324， P=0.000），而（miR-RORα+DADS）組與miR-RORα組比較生長(zhǎng)又變慢，瘤體變小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=86.356，P=0.000）；③（MGC803+DADS）組和miRRORα組分別與對(duì)照組腫瘤體積變化趨勢(shì)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=109.278和122.437，均P=0.000），而（miR-RORα+DADS）組與miR-RORα組腫瘤體積變化趨勢(shì)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=78.905，P=0.000）。見附表。

2.5 DADS與沉默RORα對(duì)裸鼠移植瘤組織EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)顯示，RORα沉默組較MGC803細(xì)胞對(duì)照組的Ki-67、Snail及Vimentin陽(yáng)性表達(dá)均增強(qiáng)，E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)減弱。但是MGC803+DADS組與（RORα沉默組+DADS組）結(jié)果相反，Ki-67、Snail及Vimentin陽(yáng)性表達(dá)均減弱，E-cadherin陽(yáng)性增強(qiáng)。見圖7。

附表 各組移植瘤不同時(shí)間平均體積 （n=5，cm3，±s）

附表 各組移植瘤不同時(shí)間平均體積 （n=5，cm3，±s）

注：1）與MGC803比較，P＜0.05；2）與miR-RORα比較，P＜0.05

組別70 d MGC803 0.401±0.14 1.206±0.28 2.832±0.44 3.761±0.49 6.656±0.46 10.544±0.59 MGC803+DADS 0.327±0.19 0.831±0.24 2.367±0.42 3.061±0.48 5.367±0.47 7.835±0.581）miR-RORα 0.555±0.18 1.821±0.24 3.795±0.37 5.734±0.47 9.787±0.62 15.661±0.671）miR-RORα+DADS 0.504±0.16 1.385±0.21 3.211±0.33 4.011±0.25 8.324±0.58 13.003±0.692）7d21 d35 d42 d56 d

圖6DADS與沉默RORα對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 （×40）

圖7 DADS與RORα沉默對(duì)移植瘤EMT相關(guān)蛋白表達(dá)影響 （SP×40）

3 討論

眾所周知，腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移起始的重要步驟，而上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）是腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的關(guān)鍵。上皮源性腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，除形態(tài)學(xué)改變外，還具有較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型，如上皮標(biāo)志物E-cadherin、緊密連接蛋白（ZO-1）等表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物vimentin、α-SMA及N-cadherin等上調(diào)以及Snail、Slug和Twist等轉(zhuǎn)錄因子活性增強(qiáng)。因此，阻止EMT發(fā)生已成為抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的治療策略[9-11]。ZHAN等[12]研究顯示，泛素樣蛋白（NEDD8）活化酶抑制因子MLN4924可上調(diào)RORα，抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期與誘導(dǎo)凋亡。近年來(lái)，研究天然植物來(lái)源的抗腫瘤藥物抑制腫瘤EMT已成為研究熱點(diǎn)。有人發(fā)現(xiàn)，姜黃通過(guò)Wnt信號(hào)通路下調(diào)β-catenin，TCF4與vimentin和上調(diào)E-cadherin抑制EMT[13]。川陳皮素可對(duì)抗TGF-β1/Smad3信號(hào)通路抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞EMT[14]。

筆者前期研究證明，DADS可抑制MGC803細(xì)胞的增殖，增加細(xì)胞骨架蛋白合成，恢復(fù)細(xì)胞縫隙連接通訊功能，上調(diào)組蛋白乙酰化與細(xì)胞周期調(diào)控因子（p21WAF1），激活p38、抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路，調(diào)節(jié)ATR/Chk1/Cdc25C/Cyclin β1，阻滯G2/M[15-19]。筆者采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定DADS處理人胃癌細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)LIMK1下調(diào)和RORα表達(dá)上調(diào)[4]。并證實(shí)DADS通過(guò)Rac1-Pak1/ Rock1通路下調(diào)單絲氨酸蛋白激酶1（LIMK1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）和上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑 3（TIMP-3），抑制人胃癌細(xì)胞EMT與侵襲[20]。研究表明，RORα在胃癌、結(jié)腸癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、頭頸部癌及白血病等多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)RORα可體內(nèi)外抑制乳腺癌細(xì)胞增殖與侵襲等惡性表型，提示RORα可能是腫瘤治療靶點(diǎn)[6]。RORα在乳腺癌組織與細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，恢復(fù)RORα表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲能力與裸鼠移植瘤生長(zhǎng)，表明RORα是潛在的抑癌基因[21]。LEE等報(bào)告，RORα通過(guò)Wnt5a與蛋白激酶C（PKC）依賴方式負(fù)調(diào)控Wnt通路，抑制其靶基因表達(dá)[22]。筆者證明，DADS可阻斷Wnt通路上調(diào)miR-200b和miR-22，抑制胃癌細(xì)胞增殖與侵襲和誘導(dǎo)凋亡[23]。但是，DADS是否上調(diào)RORα抑制胃癌細(xì)胞EMT，尚不清楚。

本研究RT-PCR與Western blot顯示，DADS處理后，各組RORα mRNA與蛋白上調(diào)，且對(duì)照組與空載體組較沉默組效果更為顯著。相差顯微鏡顯示，RORα沉默組較MGC803細(xì)胞大小與形狀差異更明顯，纖維母細(xì)胞樣梭形細(xì)胞增多，異型性更為顯著。DADS處理對(duì)照組與沉默組較處理前細(xì)胞大小一致，大部分呈圓形或橢圓形，異型性降低，表明DADS可上調(diào)RORα抑制MGC803細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化?；赟nail、E-cadherin與Vimentin是腫瘤EMT的關(guān)鍵因子[11，24]，Ki-67是腫瘤增殖能力的重要指標(biāo)[25]，CD34是血管形成的標(biāo)志[26]。本研究進(jìn)一步檢測(cè)表明，RORα沉默較對(duì)照組與空載體組的Snail與Vimentin上調(diào)和E-cadherin下調(diào)。DADS處理后，各組Snail與Vimentin下調(diào)和E-cadherin上調(diào)。且DADS作用對(duì)照組與空載體組較沉默組效果更為明顯。免疫熒光結(jié)果與Western blot檢測(cè)結(jié)果一致。裸鼠實(shí)驗(yàn)顯示，沉默組移植瘤較對(duì)照組生長(zhǎng)增快，體重明顯增加，Ki-67、Snail、CD34與Vimentin陽(yáng)性表達(dá)均增高，E-cadherin陽(yáng)性減弱。而DADS作用對(duì)照組與RORα沉默組后，移植瘤體重低于處理前，Ki-67、Snail、Vimentin陽(yáng)性均減弱，E-cadherin陽(yáng)性增強(qiáng)。上述結(jié)果表明，DADS可上調(diào)RORα通過(guò)下調(diào)Snail與Vimentin和上調(diào)E-cadherin體內(nèi)外抑制MGC803細(xì)胞EMT。

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Up-regulation of RORα inhibits EMT in human gastric MGC803 cells induced by diallyl disulfide*

Fang Liu1,Jian Su2,Ying Zeng1,Hong Xia1,Bo Su1,Hui Ling1,Xi Zeng1,Qi Su1
[1.Cancer Institute of University of South China(Center for Gastric Cancer Research of Hunan Province/Key Laboratory of Cancer Cellular and Molecular Pathology of Hunan Provincial University),Hengyang,Hunan 421001,China;2.Department of Pathology,the Second Affiliated Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China]

ObjectiveTo investigate whether diallyl disulfide (DADS)inhibits epithelial mesenchymal trasition(EMT)in human gastric cancer MGC803 cells by up-regulation of retinoid acid receptor related orphan receptor α (RORα).MethodsThe morphological effect of MGC803 cells was observed by phase contrast microscope.The expressions of molecules correlated to EMT were detected by RT-PCR,Western blot, immunofluorescence and immunohistochemistry.The influence of DADS and silencing RORα on the growth of xenograft tumor in athymic mice was observed.ResultsPhase contrast microscopy showed that MGC803 cellsof RORα silence were discordancy in size and shape and the number of spindle cells increased.Besides,the MGC803 cells treated by DADS were found with characteristics such as size unification,round or ellipse shape,decreased spindle cells and less atypia.RT-PCR and Western blot revealed up-regulation of RORα mRNA and protein in each group treated by DADS (P＜0.05).Moreover,the effect in control group and the vector group increased compared to the RORα silence group treated by DADS (P＜0.05).RT-PCR and Western blot showed the up-regulation of Snail protein and Vimentin mRNA and protein,and down-regulation of E-cadherin mRNA and protein in the RORα silence cells (P＜0.05).However,in the MGC803 cells treated by DADS Snail and Vimentin were down-regulated and E-cadherin was up-regulated(P＜0.05). Immunofluorescence showed that the positive expressions of Snail and Vimentin in the RORα silence cells were strengthened,but E-cadherin was attenuated.Nevertheless,the positive expressions of Snail and Vimentin were attenuated,and E-cadherin was strengthened in the MGC803 cells treated by DADS.The growth of the xenograft tumor was accelerated,and the weight of the transplantation tumor increased in the RORα silence group compred to the control group (P＜0.05).The positive expressions of Ki-67,Snail,CD34 and Vimentin were obviously increased,while the positive rate of E-cadherin also increased in the RORα silence group. Inversely,the rate of the xenograft tumor growth slowed down and the volume of tumor was significantly diminished.The expressions of Ki-67,Snail,CD34 and Vimentin decreased and the positive expression of E-cadherin increased in the MGC803 cells treated by DADS.ConclusionsDADS can inhibit EMT in MGC803 cellsin vivoandin vitrothrough up-regulation of RORα.

diallyl disulfide;RORα;human gastric cancer MGC803 cell;EMT

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.18.002

1005-8982（2017）18-0007-08

2016-12-15

國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81374013）；湖南省衛(wèi)計(jì)委資助項(xiàng)目（No：B2015-182）；湖南省教育廳資助項(xiàng)目（No：17K081）

蘇琦，E-mail：suqi1945@163.com；Tel：0734-8281547