劉華松，徐蘭蘭，張軍，郭家龍，林稱意，原野，曾敏，程棟梁

[1.湖北省十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院）胸心大血管外科，湖北 十堰 442099；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院護(hù)理學(xué)院，湖北 十堰 442000]

過表達(dá)KLF4抑制非小細(xì)胞肺癌增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制*

劉華松1，徐蘭蘭2，張軍1，郭家龍1，林稱意1，原野1，曾敏1，程棟梁1

[1.湖北省十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院）胸心大血管外科，湖北 十堰 442099；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院護(hù)理學(xué)院，湖北 十堰 442000]

目的 探究KLF4調(diào)控非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）發(fā)生的作用機(jī)制，為NSCLC的臨床研究提供理論依據(jù)。方法 收集臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，免疫組織化學(xué)檢測(cè)KLF4在癌旁及癌組織中的表達(dá)，細(xì)胞水平檢測(cè)KLF4在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中的表達(dá)差異，過表達(dá)KLF4檢測(cè)對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移及EMT相關(guān)標(biāo)志物的影響。結(jié)果 KLF4在癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織中的表達(dá)，并且與患者的臨床分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，細(xì)胞水平檢測(cè)也得到了相同的結(jié)果，上調(diào)KLF4的表達(dá)抑制了細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移，同時(shí)抑制EMT相關(guān)的間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)，促進(jìn)上皮標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)論 過表達(dá)KLF4能夠抑制NSCLC增殖及EMT的發(fā)生。

KLF4；非小細(xì)胞肺癌；增殖；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及癌癥致死率在所有腫瘤中均居第一位[1]。肺癌按病理類型主要包括小細(xì)胞肺癌（SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），NSCLC占到80%以上。NSCLC患者中只有不到50%的能夠接受以手術(shù)為主的治療方案，絕大多數(shù)NSCLC患者確診時(shí)多已發(fā)展到中晚期，致使NSCLC患者的5年生存率只有15%左右，嚴(yán)重影響患者的治療及預(yù)后[2]。因此，尋找NSCLC早期診斷的特異性標(biāo)志物顯得尤為重要。

Krüppel樣因子（krüppel-like factors，KLFs）家族是廣泛存在于人類組織中的鋅指型轉(zhuǎn)錄因子，主要參與到細(xì)胞的增殖、分化、周期、胚胎形成等多個(gè)生理活動(dòng)過程中[3]。目前，KLF家族中研究最多的是KLF4基因，人類KLF4基因位于染色體9q31，其編碼的KLF4蛋白是能夠特異識(shí)別并結(jié)合DNA序列（5'-TGGGTGGGGC-3'）的轉(zhuǎn)錄因子。作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子，KLF4蛋白即能通過調(diào)控下游靶基因表達(dá)發(fā)揮生物學(xué)功能，同時(shí)也能夠結(jié)合到自身啟動(dòng)子上激活自身表達(dá)，因此，KLF4是一個(gè)雙向調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子[4]。針對(duì)KLF4與腫瘤的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，KLF4在不同的腫瘤中發(fā)揮著不同的作用。通過免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其在白血病[5]、皮膚癌[6]、結(jié)腸癌、胃癌、食管癌、膀胱癌、肝癌及宮頸癌[7]等多個(gè)腫瘤組織中均低表達(dá)，然而在口腔上皮細(xì)胞鱗癌，乳腺癌[8]以及前列腺癌[9]中卻高表達(dá)。相關(guān)的臨床研究證實(shí)KLF4的表達(dá)異常與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)，成為判斷疾病預(yù)后的重要指標(biāo)。CHALEB[10]等在研究中指出，雜合子缺失及啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致的蛋白活性降低可能是KLF4在多個(gè)腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)的重要機(jī)制。盡管KLF4與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究已取得了一定進(jìn)展，但是有關(guān)KLF4與NSCLC關(guān)系的研究卻很少[11]。最新的研究表明，KLF4在NSCLC細(xì)胞系中均低表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)Numb-KLF4信號(hào)通路在調(diào)控NSCLC的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，然而，有關(guān)KLF4參與調(diào)控NSCLC的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的機(jī)制仍不清，因此，本研究主要探究KLF4調(diào)控非小細(xì)胞肺癌EMT的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 病例資料

隨機(jī)選取十堰市太和醫(yī)院胸心外科2012年9月-2015年9月收治的NSCLC病例100例。其中，男性63例，女性37例；年齡45～78歲，平均62歲；其中鱗癌56例，腺癌32例，其他12例。術(shù)后病理檢測(cè)均已證實(shí)，術(shù)前均未接受化療和放療，臨床病理資料完整，同時(shí)選取相對(duì)應(yīng)的癌旁組織作為對(duì)照，本研究所收病例標(biāo)本已獲本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

KLF4兔抗人多克隆抗體（免疫組織化學(xué)1∶200 Western blot 1∶500武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），E-cadherin兔抗人多克隆抗體（1∶500武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），N-cadherin兔抗人多克隆抗體（1∶1 000 abcam），α-catenin兔抗人多克隆抗體（1∶1 000 CST），vimentin兔抗人多克隆抗體（1∶500 abcam），GADPH兔抗人多克隆抗體（1∶1 500北京博奧森生物技術(shù)有限公司），山羊抗兔二抗（1∶5000-10000，武漢博士德生物工程有限公司），SP系列檢測(cè)試劑盒（中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人NSCLC（A549，NCl-H460，NCl-H1299，95D）以及人胚胎肺成纖維細(xì)胞（WI-38）來源于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，用含10%胎牛血清（excellbio南美）RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone USA）培養(yǎng)NCl-H1299，其他細(xì)胞用10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞均培養(yǎng)于37℃、含5%二氧化碳CO2的培養(yǎng)箱，pMXs-hKLF4過表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)于addgene（貨號(hào)17219），按照lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染手冊(cè)的步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染

1.4 免疫組織化學(xué)法

所有組織均經(jīng)過了甲醛固定和石蠟包埋處理后，制備成厚度約為5μm的切片，采用SP免疫組織化學(xué)2步法進(jìn)行后續(xù)處理，制成的切片經(jīng)二甲苯脫蠟以及不同濃度的酒精脫水處理，后續(xù)進(jìn)行微波抗原修復(fù)，再滴加3%雙氧水H2O2孵育10 min，PBS沖洗，10%山羊血清室溫封閉30 min，接著進(jìn)行濕盒孵育KLF4抗體（1∶200）4℃過夜，第2天PBS沖洗，切片進(jìn)行生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗室溫孵育30 min，PBS沖洗，最后DAB顯色，顯微鏡下觀察，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，酒精脫水，樹膠封片。每張切片隨機(jī)選擇400倍下不重復(fù)視野5個(gè)，按陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：≥30%表達(dá)陽性。

1.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)

接種相同細(xì)胞到24孔板，設(shè)置陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染KLF4過表達(dá)質(zhì)粒，24、48、72及96 h后分別在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線圖。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

收集轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒48 h后的細(xì)胞，利用含PMSF的RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量，將變性蛋白進(jìn)行垂直凝膠電泳2 h之后，接著濕法轉(zhuǎn)膜，再5%脫脂奶粉對(duì)PVDF膜進(jìn)行室溫封閉處理1 h，封閉完的膜進(jìn)行一抗4℃孵育過夜，TBST清洗3次，進(jìn)行二抗室溫孵育1 h，TBST再次清洗3次，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)暗室曝光蛋白拍照。

1.7 遷移與侵襲

利用包埋基質(zhì)膠或不包埋基質(zhì)膠的Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲能力，消化轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)基重懸，取200μl（2×104個(gè)細(xì)胞）的單細(xì)胞懸液種植在Transwell小室的上室，下室加入600μl含10%的胎牛血清的培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱孵育24 h后，棉簽擦拭掉Transwell上室膜細(xì)胞，接著4%甲醛室溫固定10 min，0.05%結(jié)晶紫染色10 min，最后，顯微鏡200倍下每個(gè)小室隨機(jī)觀察5個(gè)視野計(jì)數(shù)并拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，KLF4與臨床病理特征關(guān)系的分析采用χ2檢驗(yàn)，隨機(jī)成對(duì)計(jì)量資料采取t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KLF4在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)

KLF4主要表達(dá)在細(xì)胞核，少部分表達(dá)在細(xì)胞漿，陽性染色呈棕黃色顆粒，陰性則為無色。KLF4在肺癌組織中的陽性表達(dá)率為23.35%，而在對(duì)應(yīng)的癌旁組織的陽性表達(dá)率高達(dá)86.14%（t=3.485，P= 0.034）。見圖1。

2.2 KLF4蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)100例NSCLC組織中KLF4的陽性表達(dá)率為64%，KLF4在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與患者所處的臨床分期、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與患者的性別、年齡、病理類型、腫瘤大小等無關(guān)。臨床分期等級(jí)越高，KLF4的表達(dá)越少（P＜0.05）；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者KLF4的陽性表達(dá)（23.07%）低于非遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者（52.45%），兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 KLF4蛋白在NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，KLF4在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)均低于WI-38中的表達(dá)，Image J軟件灰度分析蛋白表達(dá)情況，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.189，P=0.037，n=3）。見圖2。

表1 KLF4蛋白的表達(dá)與臨床病理的相關(guān)性 例

圖1 KLF4蛋白在肺癌及癌旁組織中的表達(dá) （SP×400）

2.4 過表達(dá)KLF4抑制NSCLC細(xì)胞的增殖

轉(zhuǎn)染KLF4的過表達(dá)質(zhì)粒后，A549（t=4.763，P= 0.004）和H1299（t=1.368，P=0.006）的細(xì)胞增殖能力受到抑制。見圖3。

圖2 KLF4蛋白在正常肺細(xì)胞以及NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)水平

圖3 過表達(dá)KLF4抑制NSCLC細(xì)胞的增殖能力

2.5 過表達(dá)KLF4蛋白對(duì)EMT相關(guān)標(biāo)志物的影響

A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pMXs-hKLF4過表達(dá)質(zhì)粒后，提取蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)KLF4后2種細(xì)胞的上皮標(biāo)志物E-caherin、α-catenin表達(dá)均升高，而間皮標(biāo)志物N-caherin、vimentin的表達(dá)下調(diào)（見圖4），說明過表達(dá)KLF4能夠抑制NSCLC細(xì)胞EMT的發(fā)生。

2.6 過表達(dá)KLF4蛋白對(duì)NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲的影響

瞬轉(zhuǎn)KLF4過表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)KLF4的A549細(xì)胞（t=5.763，P= 0.024；t=2.489，P=0.015，n=3）和H1299細(xì)胞（t= 1.463，P=0.033；t=3.398，P=0.107，n=3）遷移及侵襲能力均受到明顯抑制。見圖5。

3 討論

KLF4是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在參與調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、分化、周期等方面發(fā)揮著重要的作用。目前的研究已經(jīng)證實(shí)，KLF4在組織中的表達(dá)失調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，鑒于KLF4作為雙向調(diào)控因子，在腫瘤中既發(fā)揮抑癌作用，也發(fā)揮促癌作用，因此對(duì)于KLF4在腫瘤的具體作用機(jī)制仍存在諸多疑問。關(guān)于KLF4在NSCLC中的作用機(jī)制的研究，雖已有少量文獻(xiàn)報(bào)道，但是KLF4調(diào)控NSCLC及EMT的發(fā)生的研究卻很少，EMT是腫瘤惡性轉(zhuǎn)變的一個(gè)重要的標(biāo)志，EMT的發(fā)生與腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。NEHA等[12]在其研究中指出KLF4是EMT的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子；此外，有關(guān)腎纖維化的研究報(bào)道了KLF4能夠通過抑制EMT來延緩腎纖維化的發(fā)生[13]，同時(shí)Dnmt1甲基化KLF4的啟動(dòng)子促進(jìn)EMT的發(fā)生；ZHOU等[14]在其乳腺癌的研究也做了類似的研究；有文獻(xiàn)報(bào)道KLF4抑制SPARC的表達(dá)來抑制肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移；最新的研究表明，KLF4能夠抑制K-Ras誘導(dǎo)的小鼠肺癌的形成，組蛋白乙酰化可能抑制KLF4的表達(dá)[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，KLF4在肺癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織，并且KLF4的表達(dá)與患者的臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；在NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)也低于正常的肺細(xì)胞，過表達(dá)KLF4抑制NSCLC細(xì)胞的侵襲與遷移，同時(shí)，KLF4的過表達(dá)抑制了EMT的發(fā)生，因此，推測(cè)KLF4在調(diào)控NSCLC增殖及EMT的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用，可能成為NSCLC臨床早期診斷的特異性標(biāo)志物。KLF4在非小細(xì)胞肺癌中的研究較少，其機(jī)制有待深入研究。該論文收集了100例NSCLC進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，同時(shí)通過免疫組織化學(xué)分析過表達(dá)KLF4，發(fā)現(xiàn)KLF4與細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移有關(guān)，并得出過表達(dá)KLF4能夠抑制NSCLC增殖及EMT的發(fā)生這一結(jié)論。該結(jié)論有較好的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持，具有一定的理論和臨床指導(dǎo)意義。

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（張西倩 編輯）

Mechanisms of KLF4 over-expression in inhibiting proliferation and EMT of NSCLC*

Hua-song Liu1,Lan-lan Xu2,Jun Zhang1,Jia-long Guo1,Chen-yi Lin1,
Ye Yuan1,Min Zeng1,Dong-liang Cheng1
(1.Department of Thoraco-cardio-macrovascular Surgery,Shiyan Taihe Hospital(the Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine),Shiyan,Hubei 442099,China；2.Shool of Nursing, Hubei University of Medicine,Shiyan,Hubei 442000)

Objective To explore the effect of KLF4 on proliferation and epithelial mesenchymal transition(EMT) innon-small cell lung cancer(NSCLC).Methods KLF4 expression in 100 samples of surgical resected NSCLC and matched normal tumor-adjacent tissues were measured by immunohistochemical staining.KLF4 expression in WI-38 and NSCLC cell lines was detected by Western blot.The regulatory effect of KLF4 on proliferation,invasion, migration and EMT markers were confirmed by cell counting,Transwell and Western blot,respectively.Results KLF4 expression was impaired in the NSCLC tissues.Loss of KLF4 expression was correlated with poor clinicopathological features including tumor stage and distant metastasis,upregulated KLF4 attenuated proliferation, invasion and migration.Meanwhile,the expressions of N-cadherin and vimentin were markedly decreased,but E-caherin and α-catenin expressions were increased after NSCLC cells were transfected with pMXs-hKLF4. Conclusions Our work provides a novel molecular insight into KLF4-directed tumor suppression through regulation of EMT.

KLF4;NSCLC;proliferation;EMT

R734.2

A

2016-12-06

湖北省教育廳項(xiàng)目（No：B2016497）

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.19.008

1005-8982（2017）19-0040-05