周洲,李良平,高采平,鐘應佳,翟祎星,賴兵
[1.四川省醫(yī)學科學院(四川省人民醫(yī)院)消化內(nèi)科,四川 成都 610072;2.地奧九泓制藥廠前沿生物技術(shù)研究室,四川 成都 610041]
外周血捕獲循環(huán)腫瘤細胞的有效方法研究*
周洲1,李良平1,高采平1,鐘應佳2,翟祎星2,賴兵2
[1.四川省醫(yī)學科學院(四川省人民醫(yī)院)消化內(nèi)科,四川 成都 610072;2.地奧九泓制藥廠前沿生物技術(shù)研究室,四川 成都 610041]
目的 建立有效獲取腫瘤患者外周血中單個循環(huán)腫瘤細胞(CTC)的方法。方法 預先將經(jīng)DiI染色的SW480細胞混入健康成人的抗凝全血中,分別單獨采用密度梯度離心(OncoQuick)、淋巴細胞分離術(shù)(Ficoll)、“玫瑰花富集”(RosetteSep)、免疫磁珠(CELLection)及淋巴細胞分離術(shù)聯(lián)合免疫磁珠聯(lián)用(Ficoll+CELLection)富集這些腫瘤細胞,統(tǒng)計回收率并觀察純度以進行比較。再使用顯微操作儀捕獲單個NCI-H460、HCT-116、DLD-1、SW480、TF-1等探測細胞及從肝癌患者外周血中富集獲得的CTC,采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)技術(shù)分析單細胞的CD45 mRNA表達水平。結(jié)果 5組方法的腫瘤細胞回收率分別為(52.5±3.5)%、(46.6±1.9)%、(36.9±5.5)%、(14.1±3.1)%和(8.8±1.4)%;單因素方差分析表明,5組方法回收率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);SNK-q檢驗表明,除OncoQuick組和Ficoll組(P>0.05)、CELLection組和Ficoll+CELLection組(P>0.05)外,其他各組之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在熒光顯微鏡下觀察富集的腫瘤細胞,發(fā)現(xiàn)CELLection組及Ficoll+CELLection組的純度更高。qRT-PCR結(jié)果顯示,總循環(huán)數(shù)60,GAPDH Ct均值為(29.94±0.59),除了單個TF-1細胞的CD45 Ct均值為(34.21±0.22),其他單個探測細胞及CTC的CD45均無表達。結(jié)論 CELLection即免疫磁珠法配合顯微操作能有效獲取肝癌患者外周血中的單個CTC并保留其原始的分子特性,適用于后續(xù)單細胞分析與研究。該方法為CTC運用于剖析腫瘤分子的特征、評價靶向治療藥物的藥效以及監(jiān)控腫瘤的復發(fā)與轉(zhuǎn)移等臨床問題奠定了基礎。
循環(huán)腫瘤細胞;免疫磁珠法;顯微操作
腫瘤轉(zhuǎn)移是導致患者死亡的主要原因之一。它是一個多步驟、多因素相互作用的復雜過程。循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)是由腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落并釋放到外周血中的腫瘤細胞。其中部分CTC隨著血液循環(huán)分散、黏附并逐漸發(fā)展成新的轉(zhuǎn)移灶[1],可見其在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重大作用。諸多實驗結(jié)果表明,CTC與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、早期轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2-3]。由于它來源于腫瘤實體,檢測血液中的CTC能獲得更多個體化的腫瘤信息,以監(jiān)控腫瘤的復發(fā)與轉(zhuǎn)移、評價抗腫瘤藥物的藥效、分析患者的預后水平等。然而,患者外周血中的CTC數(shù)量極少[4],目前主要依據(jù)細胞密度及形態(tài)[5-6]或細胞表面免疫原性[7]分離并富集這些CTC,而后者的發(fā)展時間更長、技術(shù)相對更成熟、應用更多。
隨著分子生物學的迅速發(fā)展,單細胞分析已成為研究疾病生物標志物、克隆多樣性、致病分子機制等的重要技術(shù)手段,比如通過微芯片技術(shù)檢測其臨床標志物[8];通過微流控獲得其相關(guān)物理特征[8];通過檢測特定基因表達分析其轉(zhuǎn)錄特征或腫瘤突變情況[9];通過掃描離子電導顯微鏡搭建的納米級研究平臺在不影響細胞狀態(tài)的的條件下取出其胞內(nèi)物質(zhì)如線粒體[10]。由于血液中CTC的數(shù)量極少且難以分離,上述手段并不適用。然而,目前針對CTC的研究亟需分析其分子如DNA、RNA、蛋白質(zhì)等的特征[11],以研究其與腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)。因此,本次實驗試圖建立一種能維持分子特性、快速準確的CTC單細胞化方法。
通過傳統(tǒng)的富集方法獲得的CTC往往存在正常血液細胞如紅細胞、白細胞、血小板的污染,為后續(xù)單細胞化及分析帶來干擾。本文比較了5種商品化的富集CTC的方法,即密度梯度離心(Onco-Quick)、淋巴細胞分離術(shù)(Ficoll)、“玫瑰花富集”(RosetteSep)、免疫磁珠(CELLection)及淋巴細胞分離術(shù)聯(lián)合免疫磁珠聯(lián)用(Ficoll+CELLection)等,發(fā)現(xiàn)CELLection不僅能富集高純度的CTC,還具有可接受的回收率。隨后,利用顯微操作平臺挑選出的單個探測細胞和CTC,采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)技術(shù)檢測其生物標志物(白細胞分化抗原CD45)的mRNA表達水平。結(jié)果表明,通過CELLection即免疫磁珠法配合顯微操作獲得的單個CTC較完整地維持了其分子特性,適用于后續(xù)單細胞分析。
四川省醫(yī)學科學院、四川省人民醫(yī)院初治肝癌患者1例,對其穿刺檢測、收集癌組織并由病理學確診,同時抽取外周血4 ml;健康成人的外周血取自輸血全套檢測合格的成人志愿者。實驗所用細胞株(NCI-H460、HCT-116、DLD-1、SW480、TF-1)均購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。實驗所用試劑:DiIC18(3)染料(DiI)(碧云天生物技術(shù)研究所);Ficoll-Paque PLUS(GE);OncoQuick(Greiner Bio-One);RosetteSep CTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD36(Stemcell);CELLection Epithelial Enrich(Invitrogen);Single Cell-to-CT qRT-PCR Kit(Ambion);SsoAdvanced SYBR Green Supermix(Bio-Rad)。實驗所用儀器:PCR儀型號:S1000,購自Bio-Rad(美國);qRT-PCR儀型號:CFX96,購自Bio-Rad(美國);倒置熒光顯微鏡型號:DM IL LED,購自Leica(德國);顯微操作儀型號:TransferManNK2,購自Eppendorf(德國)。
1.2.1 血液樣本 嚴格消毒之后,用真空采血針分別采集健康成人或肝癌患者肘正中靜脈血4 ml入EDTA抗凝管,并于4 h內(nèi)開展實驗。
1.2.2 外周血中腫瘤細胞的富集 以SW480細胞作為陽性腫瘤細胞,預先用DiI將其染色,以100個/ 50μl的濃度加入4 ml健康成人的抗凝全血中。再分別用 OncoQuick、Ficoll、RosetteSep、CELLection、Ficoll+CELLection等方法富集這些腫瘤細胞,隨后將腫瘤細胞懸液在光學顯微鏡下計數(shù)并觀察,取直徑≥10μm的細胞數(shù)比血液樣本體積作為患者外周血中的CTC濃度。
1.2.3 腫瘤細胞的單細胞化 以 NCI-H460、HCT-116、DLD-1、SW480、TF-1等作為探測細胞,收集其經(jīng)正常培養(yǎng)、胰酶消化后的細胞懸液及肝癌患者外周血中富集的CTC懸液,在光學顯微鏡下依據(jù)腫瘤細胞形態(tài)學特征(細胞呈圓形、橢圓形或梭形,直徑≥10μm,細胞核完整而不規(guī)則,核漿比高等)利用顯微操作平臺(熒光顯微鏡搭配顯微操作儀)挑取單個腫瘤細胞。
1.2.4 單細胞qRT-PCR檢測生物標志物的mRNA表達水平 利用單細胞逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提取上述單個腫瘤細胞的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。先對其進行PCR預擴增:95℃預變性10 min,95℃15 s,60℃4 min,擴增14個循環(huán)。再將產(chǎn)物稀釋后使用qRT-PCR檢測:94℃預變性3 min,95℃10 s,60℃30 s,擴增60個循環(huán)。所用引物見附表,其中GAPDH的引物序列源于文獻[12],CD45的引物序列為自行設計。
附表 qRT-PCR所用引物序列表
采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示,用單因素方差分析,組間用SNK-q檢驗進行兩兩比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
先用OncoQuick、Ficoll、RosetteSep、CELLection等4種方法提取正常人的抗凝全血中預先加入的100個/50μl經(jīng)DiI染色的SW480細胞,并將其移至熒光顯微鏡下的96孔板中計數(shù)。結(jié)果顯示,4種方法的腫瘤細胞回收率分別為:OncoQuick(52.5± 3.5)%,F(xiàn)icoll(46.6±1.9)%,RosetteSep(36.9±5.5)%,CELLection(14.1±3.1)%。在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn),雖然OncoQuick有最高的回收率,但富集的CTC純度偏低(見圖1H),嚴重影響后續(xù)單細胞化操作;CELLection則反之。于是,本實驗試圖將Ficoll+CELLection聯(lián)用以期在CTC的回收率和純度上均維持較高水平。該方案先用Ficoll大量分離并去除血液樣本中的白細胞,再用CELLection富集EpCAM表達陽性的CTC。結(jié)果顯示,F(xiàn)icoll+CELLection組富集的CTC雖然純度較Ficoll組或CELLection組更高(見圖1J),但其回收率降至(8.8±1.4)%,且繁瑣的步驟不利于成功富集血液樣本中原本數(shù)量就極少的CTC。單因素方差分析表明,上述5組方法回收率的差異有統(tǒng)計學意義(F=97.95,P<0.05);SNK-q檢驗表明,除OncoQuick組和Ficoll組(P=0.075)、CELLection組和Ficoll+CELLection組(P=0.080)外,其他各組之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。綜上所述,本實驗最終選擇單獨采用CELLection富集用于后續(xù)單細胞化的CTC。
采集肝癌伴腹膜轉(zhuǎn)移病人血液樣本4 ml,采用CELLection富集其中的CTC,腫瘤細胞懸液計數(shù)為58個/ml(見圖2A)。富集后的CTC存在正常血液細胞的污染,這直接影響CTC分子水平的檢測與分析。因此,利用光學顯微鏡觀察細胞形態(tài),輔以顯微操作平臺挑取選定的單個CTC用于后續(xù)實驗。為維持CTC原有的分子特性,本實驗依據(jù)CTC體積大(直徑大于≥10μm)、細胞核完整而不規(guī)則、核漿比高等特征進行挑選,而未經(jīng)EpCAM熒光抗體染色(見圖2B)。
圖1 CELLection富集CTC有高純度及可接受的回收率
收集經(jīng)正常培養(yǎng)、胰酶消化后的NCI-H460、HCT-116、DLD-1、SW480、TF-1等探測細胞懸液,利用顯微操作平臺從中挑取單個腫瘤細胞作為對照,利用qRT-PCR技術(shù)檢測其CD45的mRNA表達水平,其中Ct值(循環(huán)閾值)與模板中的目的基因cDNA分子數(shù)成正比。由于單個細胞中總RNA量本就偏少,還需均分cDNA作為模板檢測內(nèi)參及目的基因的mRNA表達水平,在qRT-PCR后加入了預擴增步驟,并將循環(huán)數(shù)設為60次。結(jié)果顯示,探測細胞除紅系白血病細胞TF-1外,其余4種上皮來源的細胞株單個細胞均未檢測到CD45 mRNA的表達(Ct值>60);單個TF-1的CD45 Ct均值為(34.21± 0.22)(n=3);5種單個細胞的GAPDH Ct值都<35且差異較?。ㄒ妶D3A)。上述結(jié)果說明,5種探測細胞僅TF-1高表達CD45,而其余上皮來源的貼壁細胞無表達,與預期相符;制備的單細胞cDNA具有較好的濃度和質(zhì)量;該實驗方案穩(wěn)定可靠,能進一步甄別CTC和白細胞。值得注意的是,單個TF-1 CD45的擴增曲線和熔解曲線良好(見圖3C、3D),說明這次自行設計的引物能特異性擴增CD45。隨后,采用上述的方法富集并單細胞化肝癌患者血液樣本中的CTC,檢測其CD45的mRNA表達水平。結(jié)果顯示,挑取的CTC①、②、③CD45均無表達(圖3B),與上述4種單個上皮樣探測細胞的結(jié)果一致。該結(jié)果說明CELLection配合顯微操作單細胞化CTC的方案消除了正常血細胞的污染,降低了假陽性率,為后續(xù)檢測與分析提供了高質(zhì)控標準的實驗對象。
圖2 CTC的單細?胞化
圖3 單細胞化CTC的鑒定
侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤重要的生物學特性。CTC在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用,并對評價療效、推測預后等具有重要意義[13-15]。對于已確診的腫瘤患者,分析其外周血中的CTC能提供更多的病理信息,進而準確獲得維持原有分子特性的CTC是體現(xiàn)其應用價值的前提條件。迄今為止,CTC的富集方法主要基于細胞大小及形態(tài)、細胞特性如細胞密度、細胞表面免疫原性等[16]。本文首先比較了多種CTC富集方法的回收率及純度,體現(xiàn)出免疫磁珠法的優(yōu)勢,隨后利用顯微操作儀實現(xiàn)了富集后CTC的單細胞化,并通過檢測生物標志物的表達水平鑒定了單個CTC的分子特性。
本文中所用的多種CTC富集方法均存在一定的局限:①OncoQuick依據(jù)細胞密度及直徑大小分離并富集CTC[17],其步驟中初步分離的腫瘤細胞用50 ml洗液混勻再經(jīng)離心后最終CTC懸液體積約300μl。該方法雖然回收率高,但血小板、紅細胞、白細胞等污染明顯。②CELLection是以帶EpCAM抗體的磁珠去捕獲并富集血液樣本中的上皮樣CTC。該方法富集的CTC純度高,最終細胞液體積僅100~200μl,但步驟繁多,如反復多次的清洗磁珠,易導致較低的回收率。③Ficoll依據(jù)細胞密度有效分離血液中的CTC和紅細胞,但無法除去白細胞和血小板。因此,盡管它的回收率高,一般仍需與其他方法聯(lián)用來富集高純度的CTC。本研究嘗試Ficoll+ CELLection聯(lián)用富集最高純度的CTC,但繁瑣的步驟不利于成功富集血液樣本中原本數(shù)量就極少的CTC。④RosetteSep先用抗體集結(jié)紅細胞成團,再以密度梯度離心分離CTC和血細胞團。通過該方法富集的CTC中常含有凝集的紅細胞團,且紅細胞團常與CTC聚集到一起。綜上所述,本實驗最終選擇了相對較優(yōu)的CELLection富集EpCAM陽性的CTC。
顯微操作能準確挑取單個細胞用于檢測與分析,對細胞損傷小,可有效維持其原有的分子特性。本研究選擇該方法將富集后的CTC單細胞化,挑取形態(tài)、體積與正常血細胞顯著不同的細胞。隨后,本文還鑒定出單個探測細胞及挑取的CTC CD45均無表達,進一步驗證了上述聯(lián)合方法的可行性和準確度。
相較于穿刺活檢,檢測分析單個CTC對患者的傷害小,實時性和可操作性高。單細胞化的CTC還可用于體外培養(yǎng)建系,建立人源腫瘤模型[18],分析CTC之間以及病例之間的差異性[19]等后續(xù)實驗,進一步在化療藥物篩選的基礎上找到更適合患者的個體化治療方案。綜上所述,本研究為CTC的單細胞分析提供了切實可行的前置方案,為實現(xiàn)CTC在腫瘤患者臨床問題中的應用奠定了基礎。
本文通過比較 OncoQuick、Ficoll、RosetteSep、CELLection、Ficoll+CELLectio 5種方法富集外周血中腫瘤細胞的回收率及純度,建立起CELLection即免疫磁珠法配合顯微操作成功分離并鑒定肝癌患者外周血中的單個CTC的方法,為其運用于剖析腫瘤分子的特征、評價靶向治療藥物的藥效、監(jiān)控腫瘤的復發(fā)與轉(zhuǎn)移等臨床問題奠定了基礎。
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(張西倩 編輯)
Isolation of single circulating tumor cell from peripheral blood of liver cancer patients by immunomagnetic beads and micromanipulation*
Zhou Zhou1,Liang-ping Li1,Cai-ping Gao1,Ying-jia Zhong2,Yi-xing Zhai2,Bing Lai2
[1.Department of Gastroenterology,Sichuan Academy of Medical Sciences(Sichuan Provincial People's Hospital),Chengdu,Sichuan 610072,China;2.Laboratory of Advanced Biotechnology,
Di'ao Jiuhong Pharmaceutical Company,Chengdu,Sichuan 610041,China]
Objective To isolate single circulating tumor cell(CTC)from peripheral blood of liver cancer patients. Methods Four commercial kits including OncoQuick,Ficoll-Paque PLUS (Ficoll),RosetteSep and CELLection,as well as Ficoll-CELLection-combination were used to enrich DiI-stained SW480 cells added to peripheral blood of healthy adults.In order to compare the above five methods,recovery and purity of enriched tumor cells were counted or observed.Then,detection cells including NCI-H460,HCT-116,DLD-1,SW480 and TF-1,and CTCs from the peripheral blood of liver cancer patients were isolated by micromanipulation individually.Subsequently,mRNAexpression level of CD45 antigen,the leukocyte common antigen,was detected by qRT-PCR.Results Compared in pairs,the recovery of the five methods[OncoQuick(52.5±3.5)%,Ficoll(46.6±1.9)%,RosetteSep(36.9±5.5)%, CELLection(14.1±3.1)%and Ficoll-CELLection-combination(8.8±1.4)%]revealed significant differences(P<0.05)except for OncoQuick and Ficoll(P>0.05),CELLection and Ficoll-CELLection-combination(P>0.05)by one-way ANOVA test and SNK-q method.Moreover,CELLection and Ficoll-CELLection-combination enriched tumor cells with higher purity when they were observed under fluorescent microscope.In addition,CD45 mRNA expression of all single detection cells and CTC were negative except TF-1(mean Ct within 60 cycles:TF-1(34.21 ±0.22),GAPDH (29.94±0.59),others none;n=3).Conclusions The combination of immunomagnetic beads and micromanipulation is an effective method to isolate single CTC from peripheral blood of liver cancer patients.The captured single CTC keeps its original molecular characteristics for subsequent single-cell analysis.Furthermore,our method lays a foundation for clinical application of CTC,for tumor molecular characteristic analysis,therapeutic effect evaluation and treatment monitoring.
circulating tumor cell;immunomagnetic beads;micromanipulation
R730.4
A
2016-11-13
四川省科技廳資助項目(No:2014TD0028)
賴兵,E-mail:laib76@139.com;Tel:028-82855467· 34·
10.3969/j.issn.1005-8982.2017.19.007
1005-8982(2017)19-0034-06