戴寶,扈進(jìn)冬，尹姍姍，李紀(jì)順*，魏艷麗

(1.山東泰諾藥業(yè)有限公司，山東 諸城262200； 2.山東省科學(xué)院生態(tài)研究所，山東 濟(jì)南250014； 3.山東省植物保護(hù)總站，山東 濟(jì)南250100)

響應(yīng)面法優(yōu)化萎縮芽孢桿菌BsR05發(fā)酵培養(yǎng)基

戴寶1,扈進(jìn)冬2，尹姍姍3，李紀(jì)順2*，魏艷麗2

(1.山東泰諾藥業(yè)有限公司，山東 諸城262200； 2.山東省科學(xué)院生態(tài)研究所，山東 濟(jì)南250014； 3.山東省植物保護(hù)總站，山東 濟(jì)南250100)

為了提高萎縮芽孢桿菌Bacillus atrophaeus BsR05發(fā)酵液的芽孢產(chǎn)量，采用響應(yīng)面法對BsR05發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)，篩選出玉米粉、(NH4)2SO4和MgSO4·7H2O為影響產(chǎn)孢的主要因子。采用最陡爬坡路徑法確定3個因素的響應(yīng)中心點(diǎn)及最適濃度范圍，最后，通過Box-Behnken設(shè)計(jì)建立主要培養(yǎng)基成分與芽孢產(chǎn)量之間的回歸關(guān)系，并確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方為葡萄糖5 g/L、玉米粉15.9 g/L、豆粕40.0 g/L、K2HPO43.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、(NH4)2SO42.1 g/L、MgSO4·7H2O 0.40 g/L、MnSO40.02 g/L。經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，平均芽孢含量與預(yù)測芽孢含量基本一致，發(fā)酵液中BsR05的芽孢產(chǎn)量從優(yōu)化前的4.73×109CFU/mL 提高到6.02×109CFU/mL。

萎縮芽孢桿菌；培養(yǎng)基優(yōu)化；響應(yīng)面分析

隨著國家對生態(tài)環(huán)境、農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重視，人們也更加注重食品安全。目前，農(nóng)產(chǎn)品的出口以及食品貿(mào)易中農(nóng)藥殘留的標(biāo)準(zhǔn)正逐步提高[1]，國家也相繼出臺實(shí)施化學(xué)農(nóng)藥零增長、加速生物農(nóng)藥發(fā)展的政策，作為新型農(nóng)藥代表的生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)將具有廣闊的發(fā)展前景。芽孢桿菌類殺菌劑由于其可以產(chǎn)生抗逆的芽孢，并且生防功能多樣，已經(jīng)成為我國微生物農(nóng)藥的主要類型之一[2-6]。截止2016年4月，農(nóng)業(yè)部登記的生物農(nóng)藥中，各種芽孢桿菌類殺菌劑有101個。在產(chǎn)品的開發(fā)過程中菌株是根本，發(fā)酵工藝是關(guān)鍵。然而，由于我國生物農(nóng)藥研發(fā)單位和生產(chǎn)企業(yè)的發(fā)酵工藝及制劑研究技術(shù)力量還比較薄弱，造成了發(fā)酵成本偏高，從而導(dǎo)致產(chǎn)品成本高。與此同時，生物農(nóng)藥的制劑劑型單一、防治效果不理想等問題，影響了其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用推廣[7]。

萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)是芽孢桿菌屬的一個重要種，國內(nèi)也稱枯草芽孢黑色變種[8]，可以產(chǎn)生耐受不良環(huán)境的孢子，能在80 ℃以上的溫度生長，抗性強(qiáng)，無致病性，在農(nóng)業(yè)上已發(fā)現(xiàn)其對小麥全蝕病、棉鈴疫病、赤霉病等多種植物病害具有良好的防治效果[9]。菌株BsR05是本實(shí)驗(yàn)室從保護(hù)地蔬菜土壤中分離篩選到的一株生防菌，經(jīng)鑒定為萎縮芽孢桿菌，該菌株對灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、串珠鐮刀菌(FusariummoniliformeSheld)、鏈格孢(Alternariaalternata)等多種植物病原真菌具有明顯的抑制作用，在溫室盆栽試驗(yàn)中對防治黃瓜灰霉病效果顯著，具有較高的應(yīng)用潛能和研究價值。為了進(jìn)一步降低發(fā)酵成本，本研究采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)、最陡爬坡路徑法及響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對BsR05發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，期望獲得液體深層發(fā)酵培養(yǎng)高產(chǎn)孢量的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，實(shí)現(xiàn)該菌株在企業(yè)中大規(guī)?；a(chǎn)及商業(yè)化應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

萎縮芽孢桿菌BsR05菌株，由山東省科學(xué)院生物研究所應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室分離和保存。玉米粉、豆粕為市售，過80目篩備用。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)條件

采用500 mL三角瓶裝入50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，按照體積分?jǐn)?shù)5%接種量接入種子發(fā)酵液(培養(yǎng)條件)，在32 ℃，180 r/min 的振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)48 h后測定發(fā)酵液中芽孢含量。

1.3.2 培養(yǎng)基的優(yōu)化

依據(jù)Minitab16 軟件的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出BsR05發(fā)酵培養(yǎng)基中影響芽孢產(chǎn)量的主要因素，然后，應(yīng)用最陡爬坡路徑法確定主要因素的響應(yīng)中心點(diǎn)及最適濃度范圍，最后通過Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析確定最佳培養(yǎng)基配方。

1.3.2.1 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)法

經(jīng)勘測，閘底（即堰頂）高程為2.69 m，與現(xiàn)今溫瑞塘河通常水位2.62 m接近。溫州地處濱海，地勢西高東低，河流源短流急，降水后河道水位迅速升高，并經(jīng)常受潮水頂托，造成城市內(nèi)澇。古時汛期，臺風(fēng)或暴雨來臨前，閘工根據(jù)氣象情況，將水閘全部打開對河水進(jìn)行預(yù)排，騰空溫瑞塘河庫容，調(diào)蓄洪水，防止發(fā)生內(nèi)澇。由此可見，閘底（即堰頂）高程即為汛限水位，用以指導(dǎo)汛期防洪調(diào)度。

選取初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的各個組分，采用Minitab16 軟件的Plackett-Burman 設(shè)計(jì)篩選發(fā)酵培養(yǎng)基中影響芽孢產(chǎn)量的主要因素。選擇8 因子2 水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個因素取高低兩個水平(表1)。全面考察初始發(fā)酵培養(yǎng)基中8個組分對芽孢產(chǎn)量的影響。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因子和水平

Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman 單位：g/L

變量符號水平-11A葡萄糖510B玉米粉2030C豆粕粉4060 D(NH4)2SO424EKH2PO411．5FK2HPO434 GMgSO4·7H2O0．20．3HMnSO40．020．03

1.3.2.2 最陡爬坡路徑法

根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)得出的一次擬合方程，確定因素取值的中心點(diǎn)。并根據(jù)擬合方程中各變量的系數(shù)確定主要因素的爬坡方向和變化步長，發(fā)酵培養(yǎng)基中除去主要因素之外的其他組分和初始培養(yǎng)基一致。然后，根據(jù)爬坡實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵液芽孢量的變化趨勢，確定Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)及最適質(zhì)量濃度范圍。

1.3.2.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)主要因素的最適質(zhì)量濃度范圍。采用Minitab16 軟件中Box-Behnken設(shè)計(jì)3 因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面分析各因素之間的相互作用。

1.3.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用確定的最佳優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行3 次重復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，取3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值與預(yù)測值比較，驗(yàn)證模型的可靠性，確定最終的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

1.3.3 芽孢含量測定

取發(fā)酵液1 mL于1.5 mL無菌離心管中，在80 ℃水浴鍋中水浴處理15 min，采用稀釋涂布法計(jì)數(shù)芽孢生長數(shù)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。Plackett-Burman 設(shè)計(jì)的各因素水平及效應(yīng)評價見表3，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的回歸分析結(jié)果的P值可以確定對發(fā)酵液芽孢含量具有顯著影響的因子由大到小依次是玉米粉、MgSO4·7H2O 和(NH4)2SO4，從而確定這3 個因子作為下一步實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素。

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

續(xù)表2

序號ABCDEFGHY/(109CFU·mL-1)6-11-1-1-11113．8271-111-11-1-13．308-1-1111-1113．949111-111-113．121011-111-11-13．5211-1-1-1-1-1-1-1-14．08121-11-1-1-1114．54

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的回歸分析結(jié)果(表3)表明，R-Sq(調(diào)整)為93.5%，說明一次擬合方程擬合良好，可以反映實(shí)際實(shí)驗(yàn)情況。玉米粉(B)、(NH4)2SO4(D)和MgSO4·7H2O(G)的可信度水平均高于95%(P<0.05)，因此被視為對發(fā)酵芽孢數(shù)有顯著影響的因素。而其他5個因素的可信度水平均低于95%(P>0.05)，則認(rèn)為對發(fā)酵芽孢數(shù)無顯著影響。

表3 Plaekett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的回歸分析結(jié)果

注：S = 0.172 568， R-Sq= 98.2% ， R-Sq(調(diào)整) = 93.5%。

根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定玉米粉、(NH4)2SO4和MgSO4·7H2O是影響萎縮芽孢桿菌BsR05發(fā)酵液芽孢產(chǎn)量的主要因素，其中MgSO4·7H2O是正效應(yīng)因子，在設(shè)計(jì)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)時，濃度依次增加；玉米粉和(NH4)2SO4是負(fù)效應(yīng)因子，濃度依次降低。最終確定3種主要因素進(jìn)行最陡爬坡路徑實(shí)驗(yàn)的最適濃度范圍和結(jié)果見表4。BsR05發(fā)酵液中芽孢含量隨MgSO4·7H2O、玉米粉和(NH4)2SO4濃度的變化先上升后下降。在MgSO4·7H2O 0.4 g/L、(NH4)2SO42 g/L、玉米粉 15 g/L 時，BsR05發(fā)酵液中芽孢含量最高，選擇此點(diǎn)作為響應(yīng)中心點(diǎn)，進(jìn)行進(jìn)一步的響應(yīng)面分析。

表4 最陡爬坡路徑實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果分析

依據(jù)Minitab16 軟件的Box-Behnken 設(shè)計(jì)進(jìn)行3因素3水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素編碼水平見表5。每個處理重復(fù)3次，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表6。用Minitab16軟件對設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行方差分析并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸擬合，結(jié)果如表7。

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)編碼水平表

表6 Box-Behnken設(shè)計(jì)和結(jié)果

表7 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸分析結(jié)果

注：S= 0.215 438 ，R-Sq=98.6% ，R-Sq(調(diào)整) =96.5%。

利用Minitab16.0回歸擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，獲得芽孢產(chǎn)量對發(fā)酵參數(shù)的三元二次回歸方程:

Y=(6.03)-0.265X1+0.0.175X2+0.07X3-0.697X12-0.717X22-0.867X32-0.190X1X2+0.025X1X3+0.015X2X3。

該模型的決定系數(shù)R-Sq(調(diào)整)為96.5%，表明該回歸方程的擬合程度較好，實(shí)驗(yàn)誤差小，能較好地反映3種主要因素與芽孢產(chǎn)量之間的關(guān)系，因此，可以用于BsR05發(fā)酵液中芽孢產(chǎn)量的分析和預(yù)測。采用Minitab軟件繪制響應(yīng)面圖，如圖1所示。

A 固定水平：(NH4)2SO4 2 g/L;B 固定水平：玉米粉 15 g/L;C 固定水平：MgSO4·7H2O 0.4 g/L。圖1 3種主要因素交互作用對BsR05發(fā)酵產(chǎn)孢影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plot for the interaction effects of 3 major factors on sporulation of BsR05 fermentation

Minitab16回歸擬合方程及響應(yīng)面圖表明，當(dāng)(NH4)2SO4濃度不變時，產(chǎn)孢量隨著玉米粉和MgSO4·7H2O濃度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并且MgSO4·7H2O變化幅度較玉米粉大，主要原因是MgSO4·7H2O在特定濃度下可以加速產(chǎn)孢；當(dāng)玉米粉濃度不變時，產(chǎn)孢量隨 (NH4)2SO4濃度的升高呈緩慢增加趨勢，伴隨MgSO4·7H2O濃度的升高產(chǎn)孢量增加速度較快，且呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；當(dāng)MgSO4·7H2O濃度不變時，產(chǎn)孢量隨著玉米粉和(NH4)2SO4濃度的升高同樣呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，但變化幅度略微平緩。此外，根據(jù)響應(yīng)面圖分析，可以發(fā)現(xiàn)在較高濃度下的玉米粉、(NH4)2SO4和MgSO4·7H2O不利于BsR05發(fā)酵產(chǎn)孢。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

采用Minitab16 軟件中的響應(yīng)優(yōu)化器可以獲得上述3種主要因素的最優(yōu)值點(diǎn)為玉米粉15.86 g/L、(NH4)2SO42.09 g/L和MgSO4·7H2O 0.405 g/L，在發(fā)酵條件下預(yù)測的發(fā)酵產(chǎn)芽孢的最大數(shù)為6.08×109CFU/mL。在該發(fā)酵條件3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為5.87×109CFU/mL、6.15×109CFU/mL和6.02×109CFU/mL，平均值為(6.02±0.09)×109CFU/mL，與預(yù)測值 6.08×109CFU/mL基本一致，實(shí)驗(yàn)數(shù)值和預(yù)測值擬合性高，說明建立的模型是有效的。最后確定經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后BsR05菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖5 g/L，玉米粉15.9 g/L，豆粕40.0 g/L，K2HPO43.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，(NH4)2SO42.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.40 g/L,MnSO40.02 g/L，水1 000 mL。

3 討論

發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化是微生物殺菌劑實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)。Plackett-Burman設(shè)計(jì)法可以快速、有效地從大量的影響因素中篩選出其中的關(guān)鍵因素[11]，已成為微生物發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化過程中顯著因子篩選的通用方法之一。在此基礎(chǔ)上使用響應(yīng)面分析法可以進(jìn)一步分析、篩選并獲得多個顯著因子之間交互作用的影響，可以同時優(yōu)化影響響應(yīng)值的多個變量。與其他優(yōu)化方法相比，響應(yīng)面法可以減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)、用時更短，同時還可獲得多元二次回歸方程以精確預(yù)測最終產(chǎn)量，結(jié)果可靠，常被用于微生物發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵過程的條件優(yōu)化。如張丹等[12]利用響應(yīng)面法對一株產(chǎn)蛋白酶菌株進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，優(yōu)化后該蛋白酶酶活力最大值為2504.8 U，酶活力較優(yōu)化前提高了4倍。劉京蘭等[13]采用響應(yīng)面法對生防解淀粉芽孢桿菌CC09發(fā)酵產(chǎn)iturin A進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后生防解淀粉芽孢桿菌CC09合成iturin A的產(chǎn)量達(dá)501 mg/L，較優(yōu)化前提高了4.2倍，且發(fā)酵成本是利用改良LB培養(yǎng)基的4.3%。李悅等[14]在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)分析及響應(yīng)面法對纖維素酶高產(chǎn)菌小刺青霉(Penicilliumspinulosum)16-7進(jìn)行發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化，優(yōu)化后菌株產(chǎn)內(nèi)切纖維素酶活(CMCase activity)為387.58 U、濾紙酶活(filter paper activity)為128.86 U，比優(yōu)化前提高49.07 %。李雯靜等[15]采用響應(yīng)面法對一株羊源丁酸梭菌的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后芽胞數(shù)為1.478×108CFU/mL，是優(yōu)化前的2.7 倍。上述例證均表明，響應(yīng)面分析法是一種科學(xué)、有效的優(yōu)化分析方法。

芽孢桿菌是一種重要的生防因子，可以定殖于寄主植物根、莖、葉部位，從而與病原菌競爭營養(yǎng)和侵染位點(diǎn)；有些芽孢桿菌還可以分泌抗菌物質(zhì)、抑制病原菌生長；可以誘導(dǎo)植物抗病性、抵御植物病原菌侵害，從而有效地防治植物病害。而且，由于芽孢桿菌能夠產(chǎn)生抗逆的芽孢的抵御不良環(huán)境的影響，是一類理想的生防菌[16]。微生物菌劑中的活菌數(shù)是保證產(chǎn)品效果的重要指標(biāo)，活菌數(shù)量降低通常會影響生防制劑的使用效果，造成微生物殺菌劑在使用過程中防治效果不穩(wěn)定。芽孢桿菌產(chǎn)生的芽孢是一種抗逆休眠體，能夠有效地抵御不良環(huán)境影響，從而保證產(chǎn)品中活菌含量，提高產(chǎn)品保存期。因此，以芽孢產(chǎn)量為指標(biāo)優(yōu)化BsR05的發(fā)酵培養(yǎng)基在生產(chǎn)上更具有實(shí)際意義，為其工業(yè)化發(fā)酵高產(chǎn)芽孢工藝奠定了基礎(chǔ)。該發(fā)酵參數(shù)在中試和工業(yè)化的實(shí)際發(fā)酵過程中，還有待于進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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Optimization of fermentation medium composition forBacillusatrophaeusBsR05 by response surface method

DAI Bao1, HU Jin-dong2, YIN Shan-shan3, LI Ji-shun2*, WEI Yan-li2

(1. Shandong Tenov Pesticides Co.Ltd., Zhucheng 262200, China; 2.Ecology Institute of Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China; 3. Plant Protection Station of Shandong Province, Jinan 250100, China)

∶To increase the spore production ofBacillusatrophaeusBsR05, a response surface method was applied to optimize the technological conditions of BsR05 fermentation medium. Corn flour, (NH4)2SO4and MgSO4·7H2O were selected as the major factors affecting sporulation by means of Plackett-Burman design. The method of steepest ascent path was adopted to determine the response center and the optimal concentration range of these 3 factors. Finally, the regression relationship between the main medium composition and the spore yield was established by Box-Behnken design. The optimal formula for the fermentation medium was determined as follow：glucose 5 g/L，corn flour 15.9 g/L, soybean meal 40 g/L, K2HPO43.0 g/L, KH2PO41.0 g/L, (NH4)2SO42.1 g/L, MgSO4·7H2O 0.40 g/L and MnSO40.020 g/L. After repeated experiments, it was verified that the average spore content was basically consistent with the predicted spore content, and the concentration of the spore was increased from 4.73×109CFU/mL to 6.02×109CFU/mL after the optimization.

∶Bacillus atrophaeus；medium optimization；eesponse surface methodology

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.04.006

2016-10-02

山東省2015年度農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目;山東省科學(xué)院-棗莊市產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)聯(lián)合基金(201510)

戴寶(1964—)男，研究方向?yàn)樯锓柿虾蜕镛r(nóng)藥。

*通信作者，李紀(jì)順(1970—)，男，高級工程師，研究方向?yàn)樯锓柿虾蜕镛r(nóng)藥。E-mail：yewu2@sdas.org

S476

A

1002-4026(2017)04-0031-07