邱然，陸健

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院, 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

研究報(bào)告

啤酒污染菌的鑒定及其細(xì)胞膜脂肪酸的組成分析

邱然，陸健*

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院, 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

從純生啤酒中富集分離得到11株啤酒污染菌。對(duì)這11株菌進(jìn)行16S rRNA同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。結(jié)果表明：11株菌均屬于乳酸桿菌，分屬于植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、類布氏乳桿菌(Lactobacillusparabuchneri)和乳酸短桿菌(Lactobacillusbrevis)3個(gè)種。進(jìn)一步對(duì)11株菌的膜脂肪酸組成進(jìn)行分析，其脂肪酸組成變化規(guī)律與16S rRNA進(jìn)化分布高度一致。將BN01、BN02和BN03號(hào)菌接種到不同程度啤酒環(huán)境脅迫的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)隨著啤酒成分增加，菌的膜不飽和直鏈脂肪酸和鏈長(zhǎng)18和20碳的脂肪酸含量增加。該研究結(jié)果不僅對(duì)啤酒污染菌進(jìn)行了分類鑒定，而且闡述了基于膜脂肪酸調(diào)控的污染菌膜對(duì)啤酒環(huán)境脅迫的耐受機(jī)制。

啤酒；啤酒污染菌；乳酸桿菌；鑒定；脂肪酸

啤酒中含有酒花浸出物質(zhì)、乙醇、高濃度CO2及低pH、低量溶氧和一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，大多數(shù)微生物不能在啤酒環(huán)境中進(jìn)行理想的生長(zhǎng)繁殖[1]。但是有一些微生物能夠適應(yīng)啤酒中的環(huán)境，并進(jìn)行正常的生長(zhǎng)代謝，這些微生物是啤酒污染菌[2]。啤酒污染菌是一類厭氧或兼性厭氧的微生物，其中乳酸菌是啤酒污染菌中最常見的微生物，大約占啤酒污染菌的80%[3]。這些乳酸菌在啤酒中滋生會(huì)影響啤酒風(fēng)味和生物穩(wěn)定性，如啤酒變酸、產(chǎn)生雜異味、渾濁、沉淀和產(chǎn)生菌膜等，從而降低了啤酒的可飲用性，縮短了啤酒貨架期[4]。

乳酸菌污染啤酒的前提是它能夠?qū)ζ【骗h(huán)境的脅迫具有適應(yīng)能力。細(xì)胞膜是微生物與外界環(huán)境接觸和敏感部位，其脂肪酸組成與細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境脅迫密切相關(guān)[5]。啤酒污染菌的抗酒花蛋白(HopA、HopB、HopC和HitA)和調(diào)控酸脅迫相關(guān)蛋白(H+-ATPase)都位于細(xì)胞上，膜脂肪酸組成能夠調(diào)控其活性，進(jìn)而影響啤酒污染菌的抗酒花和耐酸性能[6]。另外，研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌膜脂肪酸組成在其耐受乙醇脅迫和酸脅迫方面也起到重要的調(diào)控作用[7-8]。因此本研究從市售純生啤酒富集分離啤酒污染菌，運(yùn)用16S rRNA基因序列分析方法在分子生物學(xué)水平上對(duì)所分離菌株進(jìn)行鑒定。然后對(duì)不同啤酒污染菌細(xì)胞膜的脂肪酸組成進(jìn)行分析，并進(jìn)一步研究啤酒環(huán)境脅迫對(duì)啤酒污染菌膜脂肪酸組成的影響，最終闡明啤酒污染乳酸菌對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)性及其調(diào)控機(jī)理， 進(jìn)而為啤酒污染菌的檢測(cè)、評(píng)價(jià)和控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

市售5個(gè)品牌共60瓶瓶裝(500 mL)純生啤酒，用于啤酒污染乳酸菌的分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司。NBB培養(yǎng)基(%)：葡萄糖1.5，麥芽糖1.5，酪蛋白胨0.5，酵母浸粉0.5，牛肉膏0.2，乙酸鉀0.6，磷酸氫二鈉0.2，L-半胱胺酸鹽酸鹽0.02，L-蘋果酸0.05，瓊脂2；Tween-80 0.05 ，氯酚紅0.0022 ，m(啤酒)∶m(蒸餾水)=1∶1，pH 5.8。

1.1.3 菌株

乳酸短桿菌ATCC367：來(lái)源于青貯，購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

啤酒酵母w-34/70：由江南大學(xué)生物工程菌種保藏中心提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 純生啤酒理化分析

啤酒脫氣：旋轉(zhuǎn)振蕩法[9]；pH檢測(cè)：運(yùn)用梅特勒酸度計(jì)檢測(cè)脫氣啤酒pH；乙醇濃度：頂空進(jìn)樣氣相色譜法檢測(cè)[9]；啤酒苦味值：參考文獻(xiàn)[9]。

1.2.2 啤酒污染菌的分離純化

在無(wú)菌條件下，將每瓶純生啤酒(500 mL)用超濾膜(直徑10 cm，孔徑0.22 μm)進(jìn)行過濾，然后將濾膜倒置于NBB固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，揭開超濾膜，將平板上單菌落轉(zhuǎn)接至NBB斜面上，于4 ℃進(jìn)行保藏。

在Whitley A35厭氧工作站中進(jìn)行厭氧菌篩選，包括純生啤酒過濾、培養(yǎng)和NBB培養(yǎng)基穿刺保藏。

1.2.3 啤酒污染菌理化鑒定

污染菌啤酒腐敗能力鑒定參考文獻(xiàn)[10]；顯微形態(tài)觀察，革蘭氏染色和過氧化氫酶活性參考文獻(xiàn)[11]；乳酸檢測(cè)運(yùn)用高效液相色譜法參考文獻(xiàn)[11]。

1.2.4 16S rRNA序列與菌株鑒定

[11]。

1.2.5 細(xì)胞膜脂肪酸組成檢測(cè)[7,12]

(1)菌體培養(yǎng)

將啤酒污染菌接種到MRS培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫靜止培養(yǎng)，在穩(wěn)定前期收集菌體，取一定量混勻發(fā)酵液，在4℃條件下8 000 r/min離心10 min，去離子水洗滌2遍，收集菌體，然后對(duì)其膜脂肪酸組成進(jìn)行檢測(cè)。

(2)細(xì)胞膜脂肪酸提取

取約1 g的菌體，加入7 mL甲醇氯仿(2∶1，v/v)混合溶液。室溫條件下旋渦2 h，迅速置于4℃條件下放置24 h，取出后在4℃條件下6 000 r/min離心10 min，收集上清液備用；沉淀用3.75 mL甲醇氯仿水(2∶1∶0.8，體積比)混合溶液潤(rùn)洗，在4℃條件下6 000 r/min離心10min，收集上清液備用。將前面兩次離心所得上清液合并，在其中加入5 mL、4℃預(yù)冷的水氯仿(1∶1，v/v)轉(zhuǎn)換為雙向體系。用移液管移出氯仿(下相)，此相包括細(xì)胞膜脂，迅速氮吹蒸發(fā)溶劑，獲得約50 μL的細(xì)胞膜脂，迅速加入1 mL(4℃)預(yù)冷的氯仿甲醇(1∶1，v/v)混合溶液，樣品于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)脂肪酸甲酯化

將所得細(xì)胞膜脂肪酸樣品重新氮吹，蒸發(fā)除去氯仿:甲醇混合溶液，加入3 mL KOH的甲醇溶液，70 ℃水浴回流5 min。冷卻加入1 mL三氯化硼乙醚溶液70 ℃水浴回流5 min，冷卻。加入3 mL正己烷提取3次。合并提取液，用甲醇潤(rùn)洗，移除上層溶液，加入飽和NaCl，放置3～5 min，氮?dú)獯蹈桑? mL正己烷定容，獲得脂肪酸甲酯待測(cè)樣品。

(4)脂肪酸分析

氣相色譜分析條件：采用HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為高純氦氣，柱流速1 mL/min，柱前壓73.0 kPa，柱起始溫度70℃，保持2 min，以5℃/min升至230℃，保持20 min，再以5℃/min升至280℃，保持15 min，分流進(jìn)樣1 μL，分流比20∶1。

質(zhì)譜分析條件：用電子轟擊源(EI)分析，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，選取全程離子碎片掃描(SCAN)模式，質(zhì)量掃描范圍40～650，溶劑延遲3.5 min。

(5)脂肪酸組成分析

細(xì)胞膜脂肪酸峰面積總和認(rèn)為是100%，根據(jù)每種脂肪酸峰面積占總峰面積的比例計(jì)算脂肪酸的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即：

飽和度和鏈分支組成分析：直鏈飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和，直鏈不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和，支鏈飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和，支鏈不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和；鏈長(zhǎng)組成分析：不同長(zhǎng)度脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和。

1.2.6 啤酒環(huán)境脅迫對(duì)膜脂肪酸組成的影響

將啤酒污染菌接種到MRS培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫靜止培養(yǎng)48 h，然后用無(wú)菌MRS培養(yǎng)基稀釋發(fā)酵液濃度至OD600=0.2。將稀釋發(fā)酵液以1%接種量分別接種到培養(yǎng)基M(MRS培養(yǎng)基)、培養(yǎng)基M/B(50% MRS培養(yǎng)基+50%啤酒)和培養(yǎng)基B(啤酒)中，30 ℃恒溫靜止培養(yǎng)，在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期取一定量混勻發(fā)酵液，在4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min，去離子水洗滌2遍，收集菌體，然后對(duì)其膜脂肪酸組成進(jìn)行檢測(cè)。生物量運(yùn)用MRS平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1啤酒的理化性質(zhì)

50瓶5個(gè)品牌的瓶裝純生啤酒的pH、乙醇濃度和苦味值進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。5個(gè)品牌的純生啤酒的pH范圍為pH3.9～pH4.2，乙醇濃度范圍為2.2%～2.3%和苦味值范圍為7.2～8.0。

表1 5個(gè)品牌啤酒的理化指標(biāo)(n=10)

2.2啤酒污染菌的分離純化

7個(gè)菌落從NBB固體培養(yǎng)基從純生啤酒中被分離出來(lái)，然后經(jīng)過5代劃線純化得到7株啤酒污染菌，編號(hào)：BN01～BN07。在厭氧條件下，4株菌被分離出來(lái)，編號(hào)：ABN01～ABN04。這11株菌均能引起啤酒明顯渾濁，說(shuō)明這些菌是啤酒腐敗菌。另外，這11株菌均表現(xiàn)為短桿狀、革蘭氏陽(yáng)性、過氧化氫酶陰性和產(chǎn)乳酸。根據(jù)這一結(jié)果初步斷定這些菌為乳酸菌。

2.3啤酒污染菌的16SrRNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對(duì)上述11株啤酒污染菌進(jìn)行16S rRNA序列為分子指標(biāo)進(jìn)行菌種鑒定。運(yùn)用NCBI網(wǎng)站中BLAST程序，將所測(cè)定的11株菌株的16S rRNA序列，與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知細(xì)菌的16S rRNA序列進(jìn)行比較鑒定，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種，結(jié)果如表2所示。

表2 啤酒污染菌的16S rRNA序列對(duì)比與分子鑒定

一般認(rèn)為，16S rRNA序列同源大于98%屬于同一種。由表2結(jié)果可知，這11株啤酒污染菌與基因數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的乳酸桿菌屬的16S rRNA的同源性匹配性較高，均在98%以上，其中BN01、ABN02和ABN04號(hào)菌與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)同源性最高，BN02號(hào)菌與類布氏乳桿菌(Lactobacillusparabuchneri)同源性最高，其余菌(BN03～BN07、ABN01和ABN03)與乳酸短桿菌(Lactobacillusbrevis)同源性最高。

采用Clustal X2.1和MEGA4.1軟件進(jìn)行16S rRNA多序列對(duì)比和鄰近連接(NJ)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。

圖1 啤酒污染菌16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree based on the homologies of 16S rRNA sequences of beer bacteria

由圖1可知，來(lái)源于啤酒的污染菌同屬于乳酸桿菌屬，分屬3個(gè)不同種。菌株BN01、ABN02和ABN04與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)WCFS1處于同一分支；菌株BN02與類布氏乳桿菌(Lactobacillusparabuchneri)DSM5707處于同一分支；菌株BN03～BN07、ABN01和ABN03與乳酸短桿菌(Lactobacillusbrevis)ATCC14869和ATCC367處于同一分支。這一結(jié)果說(shuō)明污染菌與不同來(lái)源的乳酸菌可能擁有共同祖先，但在不同環(huán)境中進(jìn)化所致。也表明這些乳酸菌可能具有多樣的適應(yīng)機(jī)制能夠在不同環(huán)境脅迫中生存。

這11株菌均為L(zhǎng)actobacillus屬。Lactobacillus菌是一類革蘭氏陽(yáng)性，并且是乳酸菌的重要組成部分。在啤酒腐敗菌中，Lactobacillus菌被認(rèn)為是對(duì)啤酒生產(chǎn)極具威脅的腐敗菌，因?yàn)槠鋾?huì)對(duì)啤酒品質(zhì)和風(fēng)味產(chǎn)生不良影響。這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的多年來(lái)世界各地啤酒污染菌絕大部分是乳酸桿菌，70%以上是乳酸短桿菌的結(jié)果一致[3]。此次分離得到的11株啤酒污染菌中7株為乳酸短桿菌(L.brevis)。MENZ等[13]從澳大利亞精釀啤酒中分離出45株乳酸菌，其中34株為乳酸短桿菌(L.brevis)。HOLLEROV和 KUBIZNIALCOV[14]研究發(fā)現(xiàn)，捷克啤酒的污染菌種62.5%為乳酸短桿菌(L.brevis)。另外，本研究分離得到3株植物乳桿菌(L.plantarum)和1株類布氏乳桿菌(L.parabuchneri)。LIN等[15]會(huì)在麥汁、釀造過程或啤酒中檢測(cè)到植物乳桿菌(L.plantarum)、類布氏乳桿菌(L.parabuchneri)和布氏乳桿菌(L.buchneri)。

2.4細(xì)胞膜脂肪酸組成分析

將11株啤酒污染菌在MRS平板上進(jìn)行劃線，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，收集菌體，進(jìn)行細(xì)胞膜脂肪酸提取和脂肪酸甲酯衍生化，然后進(jìn)行氣相色譜分析，并根據(jù)飽和度、鏈分支情況和鏈長(zhǎng)分布等特征進(jìn)行總結(jié)，結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 啤酒污染菌細(xì)胞膜脂肪酸組成(飽和度和鏈分支)Fig. 2 Desaturation and branched distribution of membrane fatty acid of beer bacteria

由圖2可知，11株菌細(xì)胞膜中均含有大量飽和直鏈脂肪酸，含量從12%到60%，這說(shuō)明飽和直鏈脂肪酸在啤酒污染菌的分類及適應(yīng)環(huán)境脅迫方面都是必不可少的成分。但是，這11株啤酒污染菌細(xì)胞膜脂肪酸組成(飽和度和鏈分支)存在顯著差異。11株菌膜脂肪酸的飽和度和鏈分支情況大致可分為2大類，其中以BN03～BN07、ABN01、ABN03號(hào)菌為一類，含有不飽和直鏈和飽和直鏈脂肪酸，兩者比例從86∶12到46∶48。另外，以BN01、BN02、ABN02和ABN04為另一類，與第一類相比，這2株菌不飽和直鏈脂肪酸含量明顯降低，出現(xiàn)比例較高的飽和支鏈脂肪酸，含量分別為21.18%和53.29%。釀酒酵母菌的不飽和直鏈脂肪酸含量高達(dá)94.5%，飽和直鏈脂肪酸含量為4.9%，這一比例與污染乳酸菌具有明顯的區(qū)別。

圖3 啤酒污染菌細(xì)胞膜脂肪酸組成(鏈長(zhǎng))Fig. 3 Chain length distribution of membrane fatty acid of beer bacteria

圖3表示11株啤酒污染菌細(xì)胞膜脂肪酸的鏈長(zhǎng)分布。這些菌中含有鏈長(zhǎng)為C14到C20的脂肪酸，但組成上存在差異，BN03～BN07、ABN01、ABN03號(hào)菌的脂肪酸鏈長(zhǎng)組成相對(duì)集中。主要含有C16和C18脂肪酸，占總脂肪酸的99%以上。釀酒酵母脂肪酸鏈長(zhǎng)分布與此相似，C16和C18脂肪酸的含量占總脂肪酸97.5%。BN01、BN02、ABN02、ABN04號(hào)菌的脂肪酸鏈長(zhǎng)組成相對(duì)復(fù)雜，BN01、ABN02、ABN04號(hào)菌主要是C15和C20占總脂肪酸約50%，C16、C17和C18占約48%。BN02號(hào)菌主要是C16和C17占總脂肪酸70%。

結(jié)合前文所述，以16S rRNA序列構(gòu)建的進(jìn)化樹分布為依據(jù)來(lái)分析脂肪酸組成的變化趨勢(shì)。根據(jù)16S rRNA序列進(jìn)化樹分布可將11株啤酒污染菌分為3類，這與細(xì)胞膜脂肪酸組成分類高度一致。脂肪酸是微生物細(xì)胞膜重要組成成分，微生物具有其獨(dú)特的膜脂肪酸指紋圖譜，與微生物分子生物學(xué)分類具有高度同源性。目前國(guó)內(nèi)外已有將脂肪酸用于微生物分類鑒定的報(bào)道[16]。因此，可以通過膜脂肪酸組成對(duì)啤酒污染菌進(jìn)行分離和鑒定，可以縮短檢測(cè)時(shí)間和節(jié)省檢測(cè)經(jīng)費(fèi)。

2.5啤酒環(huán)境脅迫對(duì)細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響

細(xì)胞膜脂肪酸組成會(huì)隨著細(xì)胞環(huán)境的變化而發(fā)生相應(yīng)的變化。本研究以BN01、BN02和BN03號(hào)菌和乳酸短桿菌ATCC367(分離于青貯)為例，研究其細(xì)胞膜脂肪酸對(duì)啤酒環(huán)境脅迫的響應(yīng)。將BN01、BN02和BN03號(hào)菌分別接種到培養(yǎng)基M(MRS培養(yǎng)基)、培養(yǎng)基M/B(50%MRS培養(yǎng)基+50%啤酒)及培養(yǎng)基B(啤酒)中，ATCC367菌接種到培養(yǎng)基M(MRS培養(yǎng)基)和培養(yǎng)基M/B(50%MRS培養(yǎng)基+50%啤酒)中，然后在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期收集菌體，對(duì)其膜脂肪酸組成進(jìn)行分析及分布規(guī)律進(jìn)行總結(jié)，結(jié)果見圖4和圖5。

I-M：對(duì)數(shù)期-培養(yǎng)基M；I-M/B：對(duì)數(shù)期-培養(yǎng)基M/B；I-B：對(duì)數(shù)期-培養(yǎng)基B;II-M：穩(wěn)定期-培養(yǎng)基M；II-M/B：穩(wěn)定期-培養(yǎng)基M/B；II-B：穩(wěn)定期-培養(yǎng)基B圖4 不同啤酒含量條件下乳酸短桿菌BN03和ATCC367細(xì)胞膜脂肪酸組成(飽和度和鏈分支)Fig. 4 Desaturation and branched distribution of membrane fatty acid of Lactobacillus brevis BN03 and ATCC 367 at different content of beer

I-M：對(duì)數(shù)期-培養(yǎng)基M；I-M/B：對(duì)數(shù)期-培養(yǎng)基M/B；I-B：對(duì)數(shù)期-培養(yǎng)基B;II-M：穩(wěn)定期-培養(yǎng)基M；II-M/B：穩(wěn)定期-培養(yǎng)基M/B；II-B：穩(wěn)定期-培養(yǎng)基B圖5 不同啤酒含量條件下乳酸短桿菌BN03和ATCC367細(xì)胞膜脂肪酸組成(鏈長(zhǎng))Fig. 5 Chain length distribution of membrane fatty acid of Lactobacillus brevis BN03 and ATCC 367 at different content beer

由圖4可知，在不同條件下BN01、BN02和BN03號(hào)菌膜脂肪酸類型保持不變，含有飽和、不飽和直鏈脂肪酸和飽和支鏈脂肪酸，但它們比例發(fā)生變化，隨著啤酒含量的增加，膜不飽和脂肪酸直鏈含量逐漸增加，飽和直鏈和飽和支鏈脂肪酸含量逐漸降低。這種脂肪酸組成變化在穩(wěn)定期比對(duì)數(shù)期更加顯著。由此可見啤酒腐敗乳酸菌膜不飽和脂肪酸含量增加在適應(yīng)啤酒環(huán)境脅迫方面起到重要作用。

短乳酸桿菌ATCC367與BN03的16S rRNA的同源性匹配達(dá)到99%，但ATCC367菌來(lái)源于青貯，不具備在啤酒中繁殖生長(zhǎng)的能力。達(dá)到穩(wěn)定期，ATCC菌在MRS培養(yǎng)基的生物量(8.14 lg CFU/mL)比BN03菌生物量(8.05 lg CFU/mL)略低；在50%MRS培養(yǎng)基+50%啤酒中，ATCC367菌的生物量(3.54 lg CFU/mL)顯著低于BN03菌的生物量(6.39 lg CFU/mL)；ATCC菌在啤酒中不能生長(zhǎng)繁殖，BN03菌在啤酒中的生物量為5.06 log cfu/mL。ATCC367菌在MRS培養(yǎng)基和50%MRS培養(yǎng)基+50%啤酒中膜脂肪酸組成類型與BN03相似。對(duì)數(shù)期ATCC367菌在含50%啤酒的MRS培養(yǎng)基中不飽和直鏈脂肪酸含量比在MRS培養(yǎng)基中升高了4.31%；穩(wěn)定期分別升高了11.62%。由此結(jié)果可知，ATCC367菌膜脂肪酸含量隨啤酒含量增加而增加，但是其增加量顯著低于BN03菌。這一結(jié)果說(shuō)明啤酒腐敗菌膜不飽和脂肪酸的增加范圍比非腐敗菌較高，這可能是腐敗菌適應(yīng)啤酒環(huán)境脅迫的主要原因。

啤酒中含有高濃度乙醇(0.5%～10% vol)，酒花苦味質(zhì)(約17～55 mg/L異α-酸)和pH值呈酸性(3.8～4.7)等環(huán)境脅迫條件[17]。這些啤酒環(huán)境脅迫對(duì)啤酒污染菌膜脂肪酸組成產(chǎn)生了影響。研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌細(xì)胞膜脂肪酸的不飽和度決定了細(xì)胞膜的厚度和黏度，進(jìn)而提高對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)性[18]。趙文英等[7]研究發(fā)現(xiàn)酒酒球菌SD-2a在乙醇脅迫條件下，細(xì)胞膜通過調(diào)整層膜脂與乙醇平衡，進(jìn)而抵制由于乙醇在膜上聚集所產(chǎn)生毒性作用。另外，JOBIN等[19]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌細(xì)胞膜流動(dòng)性增強(qiáng)可誘導(dǎo)表達(dá)膜結(jié)合蛋白。因此推測(cè)BN03號(hào)菌在適應(yīng)乙醇脅迫環(huán)境時(shí)，細(xì)胞膜流動(dòng)性增強(qiáng)，誘導(dǎo)膜上脅迫蛋白大量表達(dá)，增加了細(xì)胞膜中蛋白與磷脂的比例，從而抵抗啤酒中乙醇引起的膜脂無(wú)序性的增加。啤酒的低pH值和異α-酸也會(huì)對(duì)乳酸菌膜脂肪酸組成產(chǎn)生影響。在酸性環(huán)境中，細(xì)胞膜不飽和脂肪酸數(shù)量會(huì)隨著環(huán)境條件變化而發(fā)生改變。研究表明，細(xì)胞膜脂肪酸組成變化在細(xì)胞適應(yīng)低pH條件方面起到關(guān)鍵作用。酸脅迫可提高細(xì)胞膜脂質(zhì)中不飽和脂肪酸含量，進(jìn)而增加細(xì)胞膜在低pH條件下的正常流動(dòng)性和生理功能。袁崢等[20]對(duì)嗜酸乳桿菌的細(xì)胞膜中脂肪酸進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)隨著pH下降，細(xì)胞膜單不飽和脂肪酸和長(zhǎng)鏈脂肪酸的含量增加。單不飽和脂肪酸和長(zhǎng)鏈脂肪酸作為“阻滲層”降低H+對(duì)細(xì)胞膜的滲透[13]?？赏茰y(cè)，細(xì)胞膜組成變化，尤其是不飽和脂肪酸含量的增加，是乳酸菌適應(yīng)酸性環(huán)境維持正常生理功能的結(jié)果。

由圖5可知，在不同條件下BN01、BN02和BN03號(hào)菌膜脂肪酸鏈長(zhǎng)組成保持不變，但它們比例發(fā)生變化，隨著啤酒含量的增加，BN01號(hào)菌中C18和C20脂肪酸含量增加，C16脂肪酸含量降低，BN02號(hào)菌中C18和C20脂肪酸含量增加，C15脂肪酸含量降低，BN03號(hào)菌中C18脂肪酸含量增加，C16脂肪酸含量減低。這種脂肪酸鏈長(zhǎng)變化在穩(wěn)定期比對(duì)數(shù)期更加顯著。對(duì)數(shù)期ATCC367菌在含50%啤酒的MRS培養(yǎng)基中C18脂肪酸含量比在MRS培養(yǎng)基中升高了4.71%；穩(wěn)定期分別升高了11.13%。酸脅迫條件下，乳酸菌膜脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度增加，使脂肪酸更容易橫跨膜雙分子層，通過疏水作用與其他脂類和蛋白結(jié)合，使脂肪酸鏈更緊湊，膜環(huán)境形成“凝膠狀”，增加膜穩(wěn)定性，進(jìn)而提高對(duì)酸脅迫的適應(yīng)性[21]。

3 結(jié)論

對(duì)純生啤酒中富集分離得到7株啤酒污染菌進(jìn)行16S rRNA同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。這11株菌均屬于乳酸桿菌，包括植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、類布氏乳桿菌(Lactobacillusparabuchneri)和乳酸短桿菌(Lactobacillusbrevis)3個(gè)種。

對(duì)11株菌的膜脂肪酸組成進(jìn)行分析，其脂肪酸組成變化規(guī)律與16S rRNA進(jìn)化分布高度一致。將BN01、BN02和BN03號(hào)菌接種到不同程度啤酒環(huán)境脅迫的培養(yǎng)基中，研究發(fā)現(xiàn)隨著啤酒成分增加，BN03號(hào)菌的膜不飽和直鏈脂肪酸和鏈長(zhǎng)18和20碳的脂肪酸含量增加。

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Identificationofbeer-spoilagebacteriumandanalysisofitsmembranefattyacidscomposition

QIU Ran, LU Jian*

(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

A total of 11 strains of beer-spoilage bacteria were isolated from draft beer. The homology of 16S rRNA was analyzed and phylogenetic tree was structured for these 11 beer-spoilage bacteria. These 11 beer-spoilage bacteria were all classified intoLactobacillusgenus, includingLactobacillusplantarum,LactobacillusparabuchneriandLactobacillusbrevis. Variation of beer-spoilage bacteria membrane lipid composition was consistent with the result of 16S rRNA. The contents of straight chain unsaturated fatty acids and C18 and C20 fatty acids of BN01, BN02 and BN03 were increased with increase of beer content. These results not only classified and identified beer-spoilage bacteria but also expound tolerance mechanism of beer environmental stress based on regulation of fatty acids of beer bacteria membrane.

beer; beer-spoilage bacteria;Lactobacillus; identification; membrane fatty acids

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013105

博士研究生(陸健教授為通訊作者，E-mail：jlu@jiangnan.edu.cn)。

863計(jì)劃(啤酒用新酶創(chuàng)制與低碳制造關(guān)鍵技術(shù)研究2013AA102109)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目

2016-10-08，改回日期：2017-03-27