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高效液相色譜同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中7種磺胺類藥物殘留的方法改進(jìn)

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目的：本方法是在農(nóng)業(yè)部公告的標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上改進(jìn)，縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率。方法：樣品經(jīng)過乙酸乙酯提取、正己烷脫脂和HLB固相萃取小柱凈化后，采用agilentXDB-C18色譜柱，以甲醇-乙腈-乙酸為流動(dòng)相洗脫分離后，經(jīng)過DAD檢測(cè)器分析、外標(biāo)法定量。結(jié)果：7種磺胺類藥物能有效分離，本實(shí)驗(yàn)室所建立的高效液相色譜紫外法測(cè)定水產(chǎn)品中7中磺胺類藥物殘留的檢測(cè)方法，對(duì)比國(guó)標(biāo)法縮短了分析時(shí)間。

磺胺類藥物；高效液相色譜；固相萃??；檢 出限；回收率

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）是應(yīng)用最早的一類人工合成抗菌藥物，具有抗菌譜廣、抗菌力強(qiáng)、吸收迅速完全和價(jià)格低廉等特點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛[1]，由于SAs在動(dòng)物體內(nèi)的作用時(shí)間和代謝時(shí)間較長(zhǎng)，容易造成動(dòng)物組織中SAs殘留，人們食用該類藥物殘留的水產(chǎn)品后會(huì)出現(xiàn)急性或慢性中毒，能夠產(chǎn)生泌尿、免疫和造血系統(tǒng)紊亂的副作用，危害人類健康，造成環(huán)境污染，嚴(yán)重影響我國(guó)水產(chǎn)品出口，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為保障人類健康，各國(guó)對(duì)SAs殘留量限制越來越嚴(yán)格，我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定SAs總量不得超過100 ng/ mL。加強(qiáng)對(duì)水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留的監(jiān)測(cè)，對(duì)保護(hù)消費(fèi)者健康，保障水產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易具有重要意義。目前，水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留的檢測(cè)方法，文獻(xiàn)報(bào)道有酶聯(lián)免疫法[2]、膠體金免疫層析法[3]、高效液相-柱后衍生熒光色譜法[4]、高效液相色譜-紫外光譜法[5]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[6]等。由于高效液相色譜儀的普及，相較高效液相色譜-質(zhì)譜方法，高效液相色譜法成本較低，易于推廣。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺嘧啶（SD）、磺胺甲基嘧啶（SMR）、磺胺5-甲氧嘧啶（SMD）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺甲氧噠嗪（SMP）、磺胺氯噠嗪（SCP）、磺胺6-甲氧嘧啶（SMM）、磺胺甲基異惡唑（SMZ）、磺胺異惡唑（SFZ）、磺胺二甲氧噠嗪（SDM）、磺胺喹噁啉（SQX），純度均大于98.0%，均購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

主要試劑：乙腈（色譜純）、乙酸乙酯（色譜純）、甲醇（色譜純）、正己烷（色譜純），以上試劑均為德國(guó)Merck公司；冰乙酸（優(yōu)級(jí)純）。

固相萃取柱（Waters Oasis HLB，60mg/3mL）。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀（配備DAD檢測(cè)器Agilent1200，美國(guó)安捷倫公司）；電子天平（感量0.000 1 g，TP214，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；電子天平（感量0.01常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；均質(zhì)機(jī)（8 000～30 000 r/ min，德國(guó)IKA 型號(hào)T10 B）；離心機(jī)（5 000r/min德國(guó)希格瑪公司3K15）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠RE-5286A）； 渦混勻器（德國(guó)Heidolph型號(hào)Multi Reax）；超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；超純水儀（美國(guó)Millipore公司Direct-Q3）；固相萃取裝置（美國(guó)Supelco公司）；移液器（量程0.5～5 mL，Thermo；100～1 000 μL，20～200 μL，芬蘭百得）。

1.3 主要溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制。精密稱取7種磺胺類藥物各（10±0.01）mg，用甲醇分別溶解并定容于10 mL棕色容量瓶中，各種磺胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為1 000 μg/mL。避光冷藏保存6個(gè)月。

（2）混合標(biāo)準(zhǔn)工作液10 μg/mL的配制。分別準(zhǔn)確移取各種磺胺儲(chǔ)備液1 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，冷藏避光保存1個(gè)月。

（3）混合標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制。準(zhǔn)確取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，流動(dòng)相初始比例稀釋并定容5 mL。依次配制成0.1、0.5、1.0、2.0 μg/mL的梯度濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 色譜條件

檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm，柱溫：40 ℃，流速：0.6 mL/min，進(jìn)樣量：50 μL；色譜柱：XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm ID，5 μm，agilent公司）；流動(dòng)相A：2%乙酸-水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；流動(dòng)相C：甲醇。

流動(dòng)相梯度見表1。

1.5 測(cè)定方法

1.5.1 樣品的提取

準(zhǔn)確稱取常溫樣品（5.00±0.02）g于50 mL離心管中，加入25 mL乙酸乙酯，超聲提取1 min，加入5 g無水硫酸鈉，14 000 r/min均質(zhì)1 min，旋渦混勻1 min，5 000 r/min離心5 min，將乙酸乙酯層轉(zhuǎn)移到100 mL梨形瓶中。再向原離心管中加入25 mL乙酸乙酯，旋渦混勻1 min，5 000 r/min離心5 min，將乙酸乙酯層合并于100 mL梨形瓶中，于30 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。

表1 流動(dòng)相梯度表

表2 7種磺胺藥物的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)表

表3 魚肉樣品中7種磺胺藥物的添加平均回收率表

1.5.2 凈化

先用1 mL甲醇溶解上述殘?jiān)?，再加? mL 1%乙酸溶液，渦旋混勻，超聲1 min，轉(zhuǎn)移到新的50 mL離心管中，再向梨形瓶中加入1 mL甲醇和2 mL 1%乙酸溶液，重復(fù)上述操作。向離心管中加入8 mL正己烷，低速混勻，8 000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷層，加入8 mL正己烷重復(fù)操作一次，下層加水6 mL稀釋，待過固相萃取柱。

1.5.3 固相萃取過程

HLB固相萃取柱的平衡：依次用3 mL甲醇、6 mL純水處理；上樣：將試樣稀釋液以0.6 mL/min速度流過HLB小柱；洗滌：依次用3 mL水、2 mL 5%甲醇淋洗小柱；洗脫：最后用10 mL甲醇洗脫，流速不超過0.6 mL/min；收集洗脫液：洗脫液于30 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用1 mL流動(dòng)相的初始比例定容，過0.2 μm有機(jī)膜，供液相色譜測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

在1.4的色譜條件下對(duì)配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2，標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖參見圖1。

結(jié)果表明，7種磺胺類藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液在濃度為0.1～2.0 μg/mL，色譜峰面積與濃度之間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均不小于0.995。

2.2 方法的回收率

向魚肉空白中添加40、80 μg/ kg7種磺胺類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每個(gè)水平設(shè)4個(gè)平行對(duì)照組。分別稱取魚樣（5.00±0.02）g，添加一定體積的標(biāo)準(zhǔn)工作液，渦旋0.5 min，混勻后靜置15 min，按樣品前處理方法處理后做HPLC分析。根據(jù)各組分的峰面積?？瞻讟悠诽砑由V圖見圖2，計(jì)算相應(yīng)濃度的回收率見表3。

2.4 色譜條件的選擇的選擇

參照農(nóng)業(yè)部958號(hào)公告-12-2007[7]標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)中采用XDB-C18柱，比較不同比例的2%乙酸溶液+甲醇+乙腈梯度洗脫，結(jié)果表明按照表1的流動(dòng)相的濃度配比，7種磺胺類藥物均能達(dá)到基線分離，峰型尖銳，對(duì)稱性好，而且出峰時(shí)間也得到縮短，縮短整個(gè)運(yùn)行時(shí)間，提高分析效率。

圖1 7種磺胺類藥物濃度為1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

圖2 添加量為40 μg/kg的樣品色譜圖

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在農(nóng)業(yè)部公告958-12-2007的標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上通過對(duì)色譜條件的改進(jìn)建立高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中7種磺胺類藥物的分析方法，該方法與國(guó)標(biāo)方法比較，整個(gè)梯度洗脫運(yùn)行時(shí)間只需要16min，7種磺胺類藥物均能達(dá)到基線分離，峰型尖銳，對(duì)稱性好，縮短了分析時(shí)間，減少有機(jī)溶劑的使用，同時(shí)結(jié)果線性良好，回收率也滿足分析要求，可用于日常對(duì)水產(chǎn)品中磺胺類藥物的監(jiān)控檢測(cè)。

[1]巢磊.磺胺類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].水生態(tài)學(xué)雜志,2002,22(3):50-51.

[2]林品言,杜紅梅.酶聯(lián)免疫法快速檢測(cè)水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留[J].當(dāng)代水產(chǎn), 2016, 41(10):94-95

[3]謝瑜杰,呼秀智,孫曉錚,等.膠體金免疫層析技術(shù)在水產(chǎn)品磺胺類藥物殘留檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2017,8(2):375-379.

[4]鄭斌,余海霞,楊會(huì)成,等.高效液相色譜-在線柱后衍生熒光檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中14種磺胺類藥物殘留[J].食品科學(xué),2012,33(4):230-233.

[5]徐維海,林黎明,朱校斌,等.水產(chǎn)品中14種磺胺類藥物殘留的HPLC法同時(shí)測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2004,23(5):122-124.

[6]趙鵬,劉鑫,孫希彥,等.HPLCMS/MS法測(cè)定水產(chǎn)品中14種磺胺類藥物[J].食品研究與開發(fā),2013(23):80-83.

[7]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部958號(hào)公告-12-2007 水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留量的測(cè)定液相色譜法 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[S].北京:中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)出版社,2007.