□ 金艷紅 朱群英 南昌市疾病預防控制中心

QuEChERS耦合UPLC-MS/MS同時測定葡萄中9種植物生長調(diào)節(jié)劑

□ 金艷紅 朱群英 南昌市疾病預防控制中心

目的：采用液質(zhì)聯(lián)用同時測定葡萄中α-萘乙酸、多效唑、2、4-D、矮壯素、吲哚-3-丁酸、6-芐基腺嘌呤、氯吡脲、縮節(jié)胺和對氯苯氧乙酸9種植物生長調(diào)節(jié)劑。方法：樣品按QuEChERS方法前處理采用乙腈提取、PSA凈化，以乙腈-10 mmol/L乙酸銨（0.05%氨水）溶液為流動相，梯度洗脫，Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)不銹鋼色譜柱分離，三重四級桿質(zhì)譜多反應監(jiān)測方式檢測，外標法定量。結(jié)果：9種植物生長調(diào)節(jié)劑在線性范圍內(nèi)具有良好的線性關系，線性相關性r≥0.99，檢出限在0.15～8.89 μg/kg，加標回收率在77.2%～112.0%，相對標準偏差在2.08%～9.12%。結(jié)論：該方法耗時短、操作簡單、有機試劑使用少，靈敏度高、回收率好，適用于日常葡萄中多種植物生長調(diào)節(jié)劑檢測，可縮短檢測周期。

QuEChERS；液質(zhì)聯(lián)用；葡萄；植物生長調(diào)節(jié)劑

植物生長調(diào)節(jié)劑(Regulator)的使用已逐漸成為推動現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的重要手段，它是一類具有植物激素活性的人工合成化學物質(zhì)，屬于農(nóng)藥范疇[1]。然而，與其他農(nóng)藥一樣，植物生長調(diào)節(jié)劑具有一定的毒性?，F(xiàn)農(nóng)業(yè)植物激素使用情況增多，安全性也受到廣泛關注[2]。

隨著人們食品安全意識的提高，植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測方法不斷更新。使用方法為氣相色譜法（GC）[3-8]，需要衍生化反應，前處理過程較繁瑣；酶聯(lián)免疫法[9-11],該方法可作為一種快速篩查方法，有特異性強、靈敏度高、易于推廣等優(yōu)點，但也存在很多缺陷。高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是目前最常用的分析方法，液相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用法以其抗干擾能力強、靈敏度高并且能夠提供化合物結(jié)構信息而應用于多組分同時分析檢測[12-19]。本文以采用乙腈提取、PSA凈化按QuEChERS方法前處理，液質(zhì)聯(lián)用法同時測定葡萄中9種植物生長調(diào)節(jié)劑。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

超高效液相色譜儀LC-30A與三重四級桿質(zhì)譜儀LCMS-8040聯(lián)用系統(tǒng)（日本島津公司）；Organomation N-EVNP24氮吹儀；IKA MS3渦旋振蕩器；Milli-Q Direct8 超純水機；Peak Scientific氮氣發(fā)生器(NM32L)；eppendorf 5424臺式高速離心機。

1.1.2 試劑

乙腈（LCMS級）；乙酸銨、氨水，為色譜純；超純水；標準物質(zhì)：多效唑、2、4-D、矮壯素、氯吡脲，購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；縮節(jié)胺、對氯苯氧乙酸，購于上海市農(nóng)藥研究所有限公司，以上標準物質(zhì)濃度均為100 μg/mL；α-萘乙酸、吲哚-3-丁酸、6-芐基腺嘌呤為固體，購于Dr.Ehrenstorfer GmbH。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜條件

Waters AC QUITY UPLCTMBEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)不銹鋼色譜柱；流動相：A為乙腈，B為10 mmol/L乙酸銨（含0.05%氨水），梯度洗脫程序：0～7 min，95%～85%的B流動相；7.10～10.50 min 65%的B流動相；11.0～15.0 min，20%的B流動相；15.1 min 95%的B流動相；柱溫:33 ℃；進樣體積：10 μL；流速: 0.2 mL/min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源ESI，采用ESI正負模式；掃描模式：多反應監(jiān)測MRM：離子源接口電壓：±3.5 kV；脫溶劑管溫度：240 ℃；加熱模塊溫度：400℃；霧化氣流量：氮氣3.0 L/min；干燥氣流量：15 L/min；碰撞氣：氬氣；駐留時間：100 ms；延遲時間：1 ms。

表1 9種植物生長調(diào)節(jié)劑MRM參數(shù)表

1.2.3 標準使用液的的配制

用移液器分別吸取6種標準溶液（100 μg/mL）100 μL，用乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液（20∶80，V∶V）定容到10 mL，制備成6種標準物質(zhì)濃度為1 μg/mL的標準使用液。稱取0.01 gα-萘乙酸、吲哚-3-丁酸、6-芐基腺嘌呤用乙腈定容到100 mL成100 μg/ mL標準液，再用移液器分別吸取上述三種標準溶液（100 μg/mL）100μL，用乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液（20∶80，V∶V）定容到10 mL，制備成9種標準物質(zhì)濃度為1 μg/mL的標準使用液。

1.2.4 樣品處理

將樣品混勻，準確稱取10.00 g（精確到0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，超聲15 min，取出加入0.5 g氯化鈉，2.0 g硫酸鎂， 渦1 min，以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液4 mL到10 mL離心管中，加250 mg PSA、0.5 mg硫酸鎂， 渦1 min，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心3 min，準確吸取2 mL凈化液于玻璃試管中，在50 ℃下用氮氣吹干。再用乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液（20∶80，V∶V）定容至1 mL。渦旋混合1 min，過0.22 μm微孔濾膜，準備上機。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

對常用的C18反相色譜柱考察，需要從所用的色譜柱的內(nèi)徑、柱分離效果等不同角度考慮，較小流量可獲得較高離子化效率。實驗考察兩個不同型號的色譜柱1：Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)不銹鋼色譜柱，2：Shim-pack XR-ODS (3.0 mm×50 mm，2.2 μm)不銹鋼色譜柱，在相同流速下柱1分離效果較好且離子化效率高，所以選擇柱了1為本方法用的分離柱。

2.1.2 流動相的優(yōu)化

在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用中液相分離與質(zhì)譜的離子化是一對矛盾體,為實現(xiàn)有效離子化，目標化合物最好在流動相中以離子形式存在，為取得良好分離，目標化合物以非離子形式存在，所以流動相的選擇時要考慮分離效果，也要兼顧分離組分進入質(zhì)譜前的離子化效率，以獲得最佳分辨率和最高靈敏度。分別考察以乙腈-10 mmol/L乙酸銨、乙腈-10 mmol/L乙酸銨（0.5%乙酸）、乙腈-10 mmol/L乙酸銨（0.05%氨水）作為流動相，考察三者對待測化合物峰形及離子化效率的影響。結(jié)果表明，乙腈-10 mmol/L乙酸銨（0.05%氨水）、乙腈-10 mmol/L乙酸銨（0.5%乙酸）對目標物能更好分離，但乙腈-10 mmol/L乙酸銨（0.05%氨水）相對10 mmol/L乙酸銨（0.5%乙酸）能使對氯苯氧乙酸的峰形平滑。故本實驗采用乙腈-10 mmol/L乙酸銨（0.05%氨水）作為流動相。

表2 9種植物生長調(diào)節(jié)劑的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限與定量下限表

表3 9種植物生長調(diào)節(jié)劑的回收率和精密度表

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 母離子的優(yōu)化

將各植物生長調(diào)節(jié)劑配成相應單標，不接分析柱下進樣5 μL，分別在ESI（-）和ESI(＋)模式下進行Q3 Scan，最后確定各目標物的母離子質(zhì)量數(shù)。

2.2.2 碰撞能的優(yōu)化以及子離子的選擇

在確定好的母離子情況下，將0.5 μg/mL的植物生長調(diào)節(jié)劑單標，在不接色譜柱情況下，對子離子選擇以及對相應電壓和能量，優(yōu)化子離子以響應值最高為定量離子，響應其次為定性離子。MRM參數(shù)見表1，其多反應監(jiān)測（MRM）見圖1。

2.3 樣品凈化條件的優(yōu)化

為提高植物生長調(diào)節(jié)劑檢測的靈敏度和選擇性，降低樣品基質(zhì)對目標物離子化的影響，延長分析柱壽命，對提取液凈化處理以降低色素、蛋白和脂肪等基質(zhì)組分干擾。乙腈對不同極性的物質(zhì)有一定溶解能力，適合多種物質(zhì)同時檢測，故本實驗選擇乙腈作為提取劑；硫酸鎂和氯化鈉的混合加入是為避免部分干擾物（如糖）一起提取出來。

2.4 方法學試驗

2.4.1 標準曲線及方法的檢出限和定量限

用乙腈-10 mmol/L乙酸銨（0.05%氨水）（20∶80，V∶V）配成不同濃度范圍的植物生長調(diào)節(jié)混合標準溶液，以待測化合物標示濃度為橫坐標，定量離子對峰面積為縱坐標，回歸計算見表2。以3倍信噪比估算檢出限，10倍信噪比對應濃度為定量限見表2。

由表2可知，目標物線性關系良好，相關系數(shù)r值均大于0.99，可克服樣品提取、凈化及上機測定過程造成的誤差，滿足不同含量的樣品檢測，方法檢出限低。

圖1 9種植物生長調(diào)節(jié)劑的多反應監(jiān)測(MRM)色譜圖

2.4.2 方法的回收率和精密度

取葡萄空白樣品，分別加入高中低3個濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑的混合標準溶液，按1.2.4樣品前處理方法處理，每個加標水平平行測定6次，計算9種植物生長調(diào)節(jié)劑的回收率和相對標準偏差，結(jié)果見表3，可知9種植物生長調(diào)節(jié)劑有較好的回收率。

2.4.3 實際樣品檢測

應用本方法測定本地市售的12份葡萄樣品，其中在兩份葡萄樣品中都檢測出氯吡脲（8.26 μg/kg、5.74 μg/ kg），其他植物生長調(diào)節(jié)劑均未檢出。

3 結(jié)論

本文采用QuEChERS耦合液質(zhì)聯(lián)用法同時測定葡萄中9種植物生長調(diào)節(jié)劑。該方法采用乙腈提取、PSA凈化,以乙腈-10 mmol/L乙酸銨（0.05%氨水）溶液為流動相，梯度洗脫， Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)不銹鋼色譜柱分離，三重四級桿質(zhì)譜多反應監(jiān)測方式檢測，外標法定量。該方法耗時短、操作簡單、有機試劑使用少，靈敏度高、回收率好，適用于日常葡萄中多種植物生長調(diào)節(jié)劑檢測，可縮短檢測周期。

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南昌市指導性科技計劃項目（立項文號210，編號：59）。

金艷紅（1986—）女，江西吉安人，碩士，主管技師。研究方向：衛(wèi)生理化檢驗。