孫強，馬祖兵，李小芳，吳純潔，羅佳*

（成都中醫(yī)藥大學藥學院中藥材標準化教育部重點實驗室四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都611137）

紅曲發(fā)酵過程中桔霉素和黃曲霉毒素的檢測方法及控制對策芻議

孫強，馬祖兵，李小芳，吳純潔，羅佳*

（成都中醫(yī)藥大學藥學院中藥材標準化教育部重點實驗室四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都611137）

紅曲因含有多種功能活性物質而被廣泛應用于醫(yī)療、食品等領域，然而紅曲中桔霉素和黃曲霉毒素的發(fā)現(xiàn)，加之二者含量測定方法各異、標準不統(tǒng)一等因素，給我國紅曲產品的出口造成了一定的貿易壁壘，嚴重制約了我國紅曲產業(yè)的發(fā)展。因此，在紅曲的生產過程中如何快速準確檢測桔霉素和黃曲霉毒素以及如何有效進行控制，成為了當前亟待解決的問題。該文對近年來國內外對于紅曲產品中桔霉素和黃曲霉毒素的檢測方法以及控制策略進行了綜述，同時分析了各檢測方法的優(yōu)缺點，以期為提高紅曲產品的安全性提供一定的參考，從而促進我國傳統(tǒng)紅曲產業(yè)的發(fā)展。

紅曲；桔霉素；黃曲霉毒素；檢測方法；控制對策

紅曲（Monascus）是我國的傳統(tǒng)發(fā)酵產品，在我國的沿用已有上千年歷史。據(jù)《本草綱目》記載，紅曲“甘，溫，無毒。消食活血，健脾燥胃”。如今，其已暢銷國內外，在降血脂、著色、釀造以及抗光降解等方面有著廣泛應用[1-5]，近年來越來越受到西方國家的重視。然而，1995年法國學者發(fā)現(xiàn)紅曲菌會代謝出對人體有害的真菌毒素—桔霉素（citrinin），引起了國內外對紅曲霉產桔霉素安全性的高度關注，這也成為了我國紅曲出口的瓶頸。另外，紅曲生產的原料主要是大米，其在生產過程中易受外來雜菌的污染，從而產生被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構（international agency for research on cancer，IARC）劃定為Ⅰ類致癌物質的黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）[6]。本文綜述了紅曲中桔霉素和黃曲霉毒素的含量檢測方法及控制策略，并分析了各檢測方法的優(yōu)缺點，以期為我國制定專門針對紅曲中桔霉素和黃曲霉毒素的標準提供一定參考。

1 桔霉素和黃曲霉毒素的危害性

1.1 桔霉素的毒性

桔霉素（citrinin）具有嚴重的腎毒性和肝毒性[7-8]，可引起人體腎臟腫大、腎小管擴張、上皮細胞壞死及肝臟中心出血等。另據(jù)文獻報道，骨髓也是桔霉素作用的靶器官[9]。桔霉素還能致畸、致癌、致基因突變和導致細胞凋亡等[10]。目前，人們對于桔霉素所致毒性的機理并不是很清楚，但LIN Y L等[11]認為其與細胞中線粒體內鈣離子的動態(tài)平衡有關。

1.2 黃曲霉毒素的毒性

黃曲霉毒素（AF）也是紅曲中存在的一種具有嚴重安全隱患的真菌毒素，對人具有強烈的致病性和致癌性。它是由黃曲霉菌（Aspergillusflavus）、寄生曲霉菌（Aspergillus）以及紅曲霉菌（Monascus purpureus Went）感染后產生的次級代謝產物[12]。目前發(fā)現(xiàn)的黃曲霉素已超過了20種，其中黃曲霉毒素B1（AFB1）毒性最大，致癌能力最強[13]。

2 各國家或地區(qū)對于紅曲產品中桔霉素和黃曲霉毒素的標準

2.1 紅曲產品中的桔霉素標準

由于紅曲及其制品中桔霉素的檢出，各國家或地區(qū)都相繼制定了關于紅曲產品中桔霉素的限量標準。如德國要求從中國進口的紅曲必須有安全生產菌種及不含桔霉素的證明[14]。美國食品及藥物管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）也明確提出紅曲產品作為食品添加劑取得認可，必須對桔霉素進行評價[15]。部分紅曲產品中桔霉素含量的國際標準見表1。

表1 紅曲產品中桔霉素含量的國際標準Table 1 Internationalstandard for citrinin contents in Monascus products

由于紅曲中桔霉素的檢出，我國部分地區(qū)也制定了相關限量標準。我國食品國家標準GB 2761—2011《食品中真菌毒素限量》中規(guī)定，紅曲食品中的桔霉素含量≤0.05mg/kg[18]，《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》中規(guī)定，中藥紅曲中桔霉素含量≤0.05mg/kg[19]。

2.2 紅曲產品中的黃曲霉毒素標準

目前，我國未對紅曲中黃曲霉毒素的限量標準做出明確規(guī)定，而且各標準中測定方法的檢測極限也不盡相同。如國家標準“紅曲類產品中桔青霉素的測定”中對固態(tài)紅曲樣品中桔霉素的檢測定量限是80μg/kg，經實踐證明可行。然而輕工行業(yè)制定的“功能性紅曲米（粉）”行業(yè)標準里，對桔霉素的限量指標是50μg/kg，在具體操作中，該限量指標已超過現(xiàn)有儀器的靈敏度，在定量上相對來說較為困難[20]。因此，應盡快建立統(tǒng)一的質量控制標準和定量檢測方法，進而保證紅曲的安全性。

3 紅曲中桔霉素和黃曲霉毒素的含量測定方法

3.1 紅曲中桔霉素的含量測定方法

目前，紅曲中桔霉素的含量測定方法主要有抑菌圈法（inhibition zonemethod）、薄層色譜法（thin layerchromatography，TLC）、酶聯(lián)免疫法（enzyme linked immunosorbent assays，ELISA）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、高效液相色譜-質譜法（high perfor mance liquid chromatography-massspectrometry，HPLC-MS）、氣相色譜-質譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）以及毛細管電泳法（capillaryelectrophoresis，CEP）等。

3.1.1 抑菌圈法

抑菌圈法是利用待測藥物在瓊脂平板中擴散使其周圍的細菌生長受到抑制而形成抑菌圈，然后根據(jù)抑菌圈的大小來判定待測藥物抑菌效價的一種方法。陳奇等[21]以枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）為指示菌，通過濾紙片擴散法考察了4種紅曲米中桔霉素的含量，結果表明，紅曲米中桔霉素含量越高，抑菌圈越大，本法用乙醇作為桔霉素的萃取劑，安全性較好。抑菌圈法檢測紅曲中桔霉素的含量雖然較直接，操作也快速簡便，但紅曲中存在多種抗菌物質，影響因素較多，因此不夠準確。

3.1.2 薄層色譜法

薄層色譜法是常用的定性和半定量方法。薄層色譜用于紅曲中桔霉素的測定，易受到其中色素的影響而致熒光斑點被覆蓋。胡曉清等[22]以硅膠F254板作為薄層板，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸=6∶3∶1（V/V）為展開劑，利用紅曲中桔霉素在不同溶劑中脂溶性色素和水溶性色素的溶解性差異，達到了對桔霉素較好的分離效果，能排除絕大部分色素對實驗的干擾。陳蘊等[23]采用板層析法，通過目視法檢測紅曲中的桔霉素，該法桔霉素的最低檢測質量濃度為0.2mg/L，適用于低濃度桔霉素的檢測。薄層色譜在檢測桔霉素時產生的熒光較弱，在硅膠板上層析出來的樣品可能出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象而致結果不穩(wěn)定，所以該法目前僅用于桔霉素的定性測定[24-27]。

3.1.3 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫技術是目前檢測桔霉素含量最靈敏的方法。LIY N等[28]通過免疫融合和間接競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗測定了紅曲樣品中的桔霉素，檢出限為0.01 ng/m L，本法較其他ELISA法的系統(tǒng)誤差較低且具很好的特異性。汪媛媛等[29]合成了桔霉素與蛋白質偶聯(lián)的抗原，利用經過免疫的小鼠得到了桔霉素單克隆抗體，采用競爭酶聯(lián)免疫法對其中的桔霉素含量進行了測定，該法桔霉素的最低檢測濃度為10μg/L，線性范圍為10～250μg/L，IC50為100μg/L。LIY N等[30]將紅曲米中的桔霉素與匙孔血藍蛋白結合，通過克隆和融合技術以及間接競爭ELISA法測定其中桔霉素的含量，回收率為89%～92%，檢出限為0.1 ng/m L，可用于測定紅曲米中的桔霉素含量。ELISA法靈敏度高、特異性好、前處理簡單，但是其結果的重復性和可靠性易受保存條件和檢測環(huán)境的影響，且在檢測過程中需接觸到毒素標準品，對于操作人員風險較大[31]。

3.1.4 高效液相色譜法

近年來，高效液相色譜法已經成功用于紅曲米中桔霉素的含量測定。在使用HPLC法之前，往往采用不同的前處理方法對樣品進行處理，以達到最佳測定效果，常用的前處理方法有有機溶劑萃取法、固相萃取法和免疫親和柱法[32]等，其中，固相萃取法和免疫親和柱法為我國國家標準[33]所采用。GB 5009.222—2016《食品中桔青霉素的測定》[33]中，采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜法對紅曲類產品中的桔青霉素進行檢測，以乙腈和0.1%磷酸為流動相，流速為0.7m L/min進行梯度洗脫，以熒光檢測器（λex=350 nm，λem=500nm）檢測其中的桔青霉素，外標法定量，檢出限和定量限分別為25μg/kg和80μg/kg，本法與GB/T 5009.222—2008《紅曲類產品中桔青霉素的測定》相比，增加了紅曲產品的凈化步驟，擴大了適用范圍。LIXM等[34]采用甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸（7∶3∶1，V/V）超聲提取血脂康膠囊中的桔霉素，提取液經濃縮后用甲醇溶解，然后進行HPLC法檢測，建立了反相高效液相熒光檢測器法檢測血脂康膠囊中桔霉素的方法，該法檢出限和定量限分別為0.187 ng/m L和0.6 ng/m L，可用于其他紅曲產品中桔霉素的定量測定。LIU R等[35]利用超聲提取的前處理方法，通過優(yōu)化的高效液相色譜條件，以乙腈和酸性水（pH 2.5）為流動相，流速為1m L/min測定了11種商業(yè)紅曲米中的桔霉素，本法能有效定量紅曲米中的桔霉素。此法采用了很好的前處理技術，同時優(yōu)化了高效液相色譜法測定紅曲桔霉素的條件。HPLC法是目前檢測桔霉素的一種有效手段，精確靈敏，重復性高，但是紅曲產品本身成分復雜，色素含量較高，因而導致前處理過程比較復雜，且耗時較久，一般占整個分析工作里70%以上的時間[36]。

3.1.5 色譜質譜聯(lián)用法

（1）液質聯(lián)用法

液質聯(lián)用技術能夠對痕量化合物進行準確定量分析，受雜質的干擾較小。MORNARA等[37]建立了液相色譜-二極管陣列檢測器串聯(lián)熒光檢測器再串聯(lián)質譜檢測紅曲產品中桔霉素的方法，該法的檢出限和定量限分別為0.0005μg/m L和0.001μg/m L，可應用于紅曲米及制品中桔霉素的常規(guī)質量控制。吉小鳳等[38]針對紅曲產品中的桔霉素，建立了一種操作簡單、靈敏性高的液相色譜—串聯(lián)質譜法。在該法中，樣品經甲醇提取后，以甲醇∶水（含0.1%甲酸和2mmol/L乙酸銨）體積比為90∶10為流動相在液相色譜柱上進行分離，質譜采用電噴霧源（electron spray ionization，ESI）正離子方式，對桔霉素進行定性和定量分析，方法精密度為2.0%，檢測限為5μg/kg，適合固態(tài)紅曲米（粉）中痕量桔霉素的測定。

（2）氣質聯(lián)用法

氣質聯(lián)用技術近年來被廣泛用于復雜組分的分離與鑒定，具有氣相色譜的高分辨率和質譜的高靈敏度特性。LIU BH等[39]用氣質聯(lián)用法測定了6種紅曲樣品中的桔霉素，其最低檢測限可達1μg/m L，測定得到6種紅曲樣品中桔霉素的含量范圍為4.2～25.1mg/kg。氣質聯(lián)用法操作簡便，靈敏度也能滿足實際工作需求，而且在分離柱允許的溫度范圍內，桔霉素可揮發(fā)或可轉化為揮發(fā)性物質，使得氣相色譜能用于紅曲產品中桔霉素的定量測定[40]。

3.1.6 毛細管電泳法

毛細管電泳法是一種依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的電泳分離方法，常用于藥物分析領域，與液相色譜法相比，毛細管電泳所需的樣品量更少，分析時間更短，常用的有毛細管區(qū)帶電泳和膠束電動毛細管電泳[41]。NIGOVIC'B等[42]采用膠束電動毛細管電泳檢測紅曲米中洛伐他丁和桔霉素的方法，桔霉素的最低檢出限為0.08μg/kg，靈敏度較高，而且在2m in之內完成了檢測，大大縮短了檢測時間。陳軍等[43]用甲苯-醋酸乙酯混合提取劑超聲提取紅曲樣品中的桔霉素，建立了高效毛細管電泳法測定中藥紅曲中桔霉素的方法，簡便易行，重現(xiàn)性好，可用于中藥紅曲中桔霉素的含量測定。毛細管電泳法雖然靈敏度很高，但由于價格較高，在應用普及方面不如高效液相色譜法。

3.2 黃曲霉毒素的含量測定方法

紅曲及其制品在生產的過程中易受外來雜菌的污染，從而產生對肝臟等器官具有嚴重毒性的黃曲霉毒素。龔燕等[44]在傳統(tǒng)提取方法甲醇∶水（1∶1）的基礎上加氯仿進行液液萃取后，用ELISA法測定紅曲中的黃曲霉毒素B1，消除了假陽性的影響，提高了檢測的靈敏度，最低檢測限達2.5μg/kg且重復性較好。四川省中藥飲片炮制規(guī)范關于紅曲中黃曲霉毒素（以B1+B2+G1+G2計）的測定采用2015版《中國藥典》通則2351項下的高效液相色譜法和高效液相-串聯(lián)質譜法。目前暫無更多關于紅曲中黃曲霉毒素的定性和定量方法，鑒于該類物質的巨大危害，必須盡快建立起針對紅曲中黃曲霉毒素的檢測方法。

4 紅曲中桔霉素和黃曲霉毒素的控制方法

4.1 桔霉素的控制方法

紅曲霉產桔霉素由菌種的本身特性所決定，必須通過一定的技術來控制紅曲中桔霉素的產生。

4.1.1 菌株選育

劉穎等[45]對福建古田不同來源的紅曲樣品進行了分離純化，結合固定發(fā)酵進行定向篩選，得到了一株低桔霉素且產Monacolin K的紅曲菌株NM-32，經其發(fā)酵得到的產品中桔霉素含量低于國家有關有毒物質的最低檢測標準。產竹華等[46]采用60Co對紅曲菌9908進行誘變育種，篩選出一株不產桔霉素的菌株9908A，實驗發(fā)現(xiàn)該菌株在3種不同的培養(yǎng)方式上均不產生桔霉素。NIHEIT等[47]利用基因工程對紅曲霉中的聚酮合酶基因進行了重新編碼，構建了不產桔霉素的紅曲霉菌，對于菌株的選育具有一定的意義。

4.1.2 優(yōu)化發(fā)酵工藝

發(fā)酵過程中的不同發(fā)酵工藝能影響紅曲霉產桔霉素能力的高低，例如氮源[48]、脂肪酸與酮類物質[49]、金屬離子螯合劑[50]以及pH[51-52]等。YANG J等[53]在紅曲的發(fā)酵過程中，控制了各階段溶氧條件，在前期采用高濃度氧氣供應，后期則降低溶解氧的濃度，使得紅曲色素產量提高了29.6%，而桔霉素產量則降低了79.5%。CHEN M H[54]發(fā)現(xiàn)了一種利用適當溫度來有效控制紅曲霉產桔霉素的方法，而結果并不影響紅曲色素的產生。WANG C L等[55]讓紅曲霉在藍光條件下發(fā)酵，紅曲色素產量提高了28.5%，而桔霉素含量降低了79%，證明了光照對紅曲發(fā)酵產桔霉素的影響。劉宏[56]以紅光光照強度為300 lux，光照時間30min/d，光照節(jié)律12 h對紅曲中的桔青霉素進行處理，發(fā)現(xiàn)桔青霉素的含量與不處理的情況相比，降低了42.5%。

4.1.3 微生物降解控制

CHEN Y H等[57]發(fā)現(xiàn)有的微生物可將紅曲霉產生的桔霉素作為唯一碳源進行利用，從而達到降解桔霉素的作用，可在10h內將10mg/kg的桔霉素降解完全。KANPIENGJAI A[58]從泰國北部清邁74個土壤，水和廢水樣品中共獲得96個細菌，分離篩選出了兩種降解桔霉素較快的菌株陰溝腸球菌（Enterobactercloacae）PS21和根瘤桿菌（Bacillus radicicola）PS45，將其培養(yǎng)120 h后測定殘留的桔霉素含量為1.83mg/kg和2.82mg/kg。微生物對于桔霉素的降解完全徹底，綠色環(huán)保，在降解的過程中不影響紅曲產品的質量，效果理想。

4.2 黃曲霉毒素和其他雜菌毒素的控制方法

紅曲中的黃曲霉毒素和其他雜菌毒素主要來源于外來雜菌的污染，因此，可從其污染途徑入手控制其產生。李曉樓等[59]提出在紅曲米發(fā)酵過程中應加強衛(wèi)生管理，做好場地和原料的消毒滅菌處理，同時可適當加入種曲質量0.2%的99.5%乙酸來減少黃曲霉毒素和其他雜菌毒素的產生。劉春梅等[60]通過實驗證明，由菌種本身造成的污染率約為4.31%，由接種操作引起的污染率約為1.76%。因此，在發(fā)酵過程中應加強菌種的純化和滅菌處理，切實做到在每一步都避免其他雜菌污染的風險性。

5 總結和展望

本文綜述了紅曲產品中桔霉素和黃曲霉毒素的檢測方法及控制對策，同時對各檢測方法的優(yōu)缺點進行了分析，希望能為提高紅曲產品的安全性提供一定的參考。我國應該盡快制定針對紅曲中桔霉素和黃曲霉毒素的含量測定和控制方法，以利于突破紅曲產品出口的技術貿易壁壘，為我國紅曲產品走向國際市場提供技術支持。

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Detectionmethodsand controlstrategiesof citrinin and aflatoxinsduring Monascus fermentation process

SUN Qiang,MA Zubing,LIXiaofang,WU Chunjie,LUO Jia*
(The M inistry ofEducation Key Laboratory ofStandardization ofChinese HerbalMedicine,Key Laboratory ofSystematic Research, Developmentand Utilization ofChinese Medicine Resources in Sichuan Province-Key Laboratory Breeding Base ofCo-founded by Sichuan Province and MOST,Pharmacy College,Chengdu University ofTraditionalChinese Medicine,Chengdu 611137,China)

Monascus isw idely used inmedical,food and other fields,because of its various functional active substances.The detect of citrinin and aflatoxin in Monascus,and the factorssuchasthedifferentdetectionmethodsof citrininand aflatoxin contents,and standardsdisaccord lead toa certain tradebarriers forChina Monascus productsexportion,seriously hampered thedevelopmentof Monascus industry in China.Therefore,how to quickly and accurately detectcitrinin and aflatoxin and how to control them effectively in the production processof Monascus had becomean urgentproblem to be solved.The detectionmethodsand control strategies of citrinin and aflatoxin in Monascus products in recent yearswere summarized,and the advantages and disadvantages of detectionmethodswere analyzed,in order to provide some references for improving the safety of Monascus products,and promote thedevelopmentof Chinese traditional Monascus industry.

Monascus;citrinin;aflatoxin;detectionmethod;controlstrategy

TS201.6

0254-5071（2017）08-0125-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.027

2017-05-12

國家中醫(yī)藥管理局公益性行業(yè)科研專項（201507004）；四川省科技廳苗子工程項目（2016RZ0037）

孫強（1989-），男，碩士研究生，研究方向為中藥新劑型及中藥新技術。

*通訊作者：羅佳（1985-），女，講師，博士研究生，研究方向為中藥新劑型及中藥新技術。