劉燕，劉鉞，柯濤*

（1.南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南南陽(yáng)473000；2.河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司試驗(yàn)中心，河南南陽(yáng)473000）

混合原料高濃度酒精發(fā)酵工藝優(yōu)化

劉燕1，劉鉞2，柯濤1*

（1.南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南南陽(yáng)473000；2.河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司試驗(yàn)中心，河南南陽(yáng)473000）

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)混合原料高濃度酒精發(fā)酵工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果表明，影響高濃度酒精發(fā)酵因素的主次順序?yàn)榘l(fā)酵溫度＞糖化酶添加量＞發(fā)酵時(shí)間＞接種量＞搖床轉(zhuǎn)速，最佳發(fā)酵條件參數(shù)為發(fā)酵溫度33℃、糖化酶添加量160 U/g、發(fā)酵時(shí)間60 h、接種量25%、搖床轉(zhuǎn)速140 r/min。在此最佳工藝條件下，發(fā)酵醪酒精度可達(dá)到15.95%vol。

混合原料；高濃度；酒精；發(fā)酵；優(yōu)化

當(dāng)前用以支撐全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展的石油資源及能源供應(yīng)正面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，且日益嚴(yán)重的環(huán)境污染使得人們?cè)絹?lái)越關(guān)注清潔環(huán)保的可再生能源。燃料乙醇作為一種新型清潔能源，是可再生能源中生物質(zhì)能源開發(fā)利用的一個(gè)重要方向，仍有很大的發(fā)展空間[1-4]。伴隨著酒精發(fā)酵技術(shù)的不斷發(fā)展與創(chuàng)新，高濃度酒精發(fā)酵越來(lái)越受到行業(yè)的青睞。高濃度酒精發(fā)酵是以提高單位體積內(nèi)發(fā)酵醪液中可溶性固形物的含量為目的，在耐高酒精度的釀酒酵母作用下，通過(guò)發(fā)酵條件的控制，力求得到最多的發(fā)酵終產(chǎn)物—乙醇[5]。高濃度酒精發(fā)酵法可減少能量消耗、提高設(shè)備利用率、降低生產(chǎn)成本、提高酒精年產(chǎn)量，是一種具有巨大應(yīng)用價(jià)值的酒精發(fā)酵技術(shù)[6-7]。

目前，高濃度酒精發(fā)酵研究主要集中在高耐性釀酒酵母選育、發(fā)酵工藝優(yōu)化、發(fā)酵模式改進(jìn)、酶制劑添加應(yīng)用及降低發(fā)酵醪液黏度等幾個(gè)方面[8-11]。高濃度酒精發(fā)酵仍然存在一些問(wèn)題，如濃醪物料輸送、高糖及高濃度乙醇對(duì)酵母菌的抑制作用、發(fā)酵廢醪液如何分離等問(wèn)題[12]。在發(fā)酵工藝優(yōu)化方面，米慧芝等[13]采用釀酒酵母能直接發(fā)酵30%的蔗糖溶液，發(fā)酵周期只有2～3 d，其最終產(chǎn)生的酒精可以達(dá)到17.08%vol，對(duì)發(fā)展蔗糖酒精是個(gè)很好的契機(jī)。

微生物菌種是發(fā)酵工業(yè)的核心，在高濃度酒精發(fā)酵生產(chǎn)中，選育耐受高濃度、高酒精含量，高轉(zhuǎn)化率的優(yōu)良菌株可以大幅提高發(fā)酵效率和企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。前期采用紫外誘變方法對(duì)原始菌株1308進(jìn)行誘變，經(jīng)過(guò)初篩、復(fù)篩及菌株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，得到菌株YB-18的發(fā)酵能力最強(qiáng)，故以菌株YB-18為試驗(yàn)菌株開展混合原料高濃度酒精發(fā)酵優(yōu)化研究。

本試驗(yàn)結(jié)合天冠集團(tuán)乙醇生產(chǎn)用原料使用情況，為提高原料利用率，優(yōu)化發(fā)酵工藝，通過(guò)開展糖化酶添加量、發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間及搖床轉(zhuǎn)速等單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)探尋高濃度酒精發(fā)酵最佳工藝，以期為生產(chǎn)開展混合原料高濃度酒精發(fā)酵提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

面粉∶玉米粉∶木薯粉（5∶3∶2）：天冠集團(tuán)乙醇公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YB-18、1300、1308：天冠集團(tuán)；安琪干酵母：安琪酵母股份有限公司；液化酶（30 000 U/m L）：江蘇省奧谷生物科技有限公司；糖化酶（100 000U/m L）：神舟生物科技有限公司；尿素：河南心連心化肥有限公司；葡萄糖、硫酸銅、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉均為市售分析純。

一級(jí)種子培養(yǎng)基：濃度為14°Bx的麥芽汁，分裝于試管中，每支試管10m L，于121℃高壓滅菌器內(nèi)滅菌30m in，冷卻備用。

二級(jí)種子培養(yǎng)基：拌料濃度為26%的液化醪，分裝于500m L三角瓶中，并于115℃高壓滅菌器內(nèi)滅菌30min，冷卻備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：拌料濃度為34%的液化醪，分裝于1000m L三角瓶中，并于115℃高壓滅菌器內(nèi)滅菌30m in，冷卻備用。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S28電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ZHWY-211C恒溫培養(yǎng)振蕩箱：上海智城分析儀器制造有限公司；XSP-6C生物顯微鏡：上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司；DL-1萬(wàn)用電爐：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SW-C-1C超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；PL-403電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

原料粉粹：將小麥、玉米、木薯經(jīng)預(yù)處理后分別粉碎，小麥粉碎粒度為0.18mm，玉米粉碎粒度為1.50mm，木薯粉碎粒度為0.25mm。

拌料∶面粉∶玉米粉∶木薯粉（5∶3∶2），料水比為1∶1.95（g∶m L）。

液化：按試驗(yàn)方案稱取原料，并用自來(lái)水調(diào)漿，攪拌均勻后用10%的硫酸或10%的氫氧化鈉調(diào)整pH值至5.4～5.6，繼續(xù)攪勻，按15U/g原料的比例加入α-淀粉酶，然后置于98℃恒溫水浴鍋內(nèi)液化2 h，取出冷卻至室溫后補(bǔ)水至原質(zhì)量。

種子培養(yǎng)：挑取1環(huán)試管斜面種子接入液體試管內(nèi)，靜置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)8h，然后將培養(yǎng)好的液體試管接種于搖瓶?jī)?nèi)，添加尿素（1 g/kg原料），于30℃、160 r/min的搖床上培養(yǎng)16 h，得到種子懸浮液。

糖化：采用邊糖化邊發(fā)酵工藝，糖化酶在接種時(shí)加入，添加量為160U/g原料。

酒精發(fā)酵：接種量25%，控制條件：0～8 h，32℃、150 r/min；8～24 h，34℃、135 r/m in；24 h后，33℃靜置發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中定時(shí)對(duì)二氧化碳損失情況進(jìn)行稱質(zhì)量，當(dāng)質(zhì)量損失＜0.2 g/h時(shí)，結(jié)束酒精發(fā)酵。

1.3.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

本試驗(yàn)主要考察糖化酶添加量（100 U/g、120 U/g、140 U/g、160 U/g、180 U/g、200 U/g、220 U/g）；發(fā)酵溫度（31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃）；接種量（5%、10%、 15%、20%、25%、30%）；發(fā)酵時(shí)間（52 h、56 h、60 h、64 h、68 h）；搖床轉(zhuǎn)速（0、80 r/m in、100 r/m in、120 r/m in、140 r/m in、160 r/m in）等5個(gè)因素對(duì)菌株YB-18發(fā)酵的影響。

1.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以糖化酶添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）、搖床轉(zhuǎn)速（E）為考察因素，以發(fā)酵終了醪液的酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L18（35）的正交優(yōu)化試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵條件。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and leve ls of orthogonalexperiments for fermentation conditions optim ization

1.3.4 檢測(cè)方法

酒精度的測(cè)定：蒸餾-密度計(jì)法[15-16]；總糖的測(cè)定：斐林試劑滴定法[15-16]；外觀糖度的測(cè)定：密度計(jì)法[15-16]；酸度的測(cè)定：氫氧化鈉滴定法[15-16]；還原糖的測(cè)定：斐林試劑滴定法[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高濃度條件下不同菌株酒精發(fā)酵性能比較

殘還原糖是檢驗(yàn)可發(fā)酵糖是否完全利用的最準(zhǔn)確的指標(biāo)，是檢測(cè)酵母是否對(duì)糖“吃干榨凈”的指標(biāo)[17]。殘總糖是酒精發(fā)酵后未被發(fā)酵而殘余的糖分，其含量高低是衡量酒精發(fā)酵完全程度的重要指標(biāo)之一[18]。殘總糖越高，表示糖的利用率越低，反之糖的利用率越高。不同菌株在相同條件下進(jìn)行酒精發(fā)酵時(shí)，殘還原糖及殘總糖越低，菌株的發(fā)酵能力越強(qiáng)。通過(guò)不同菌株發(fā)酵情況對(duì)比，選擇發(fā)酵能力強(qiáng)的菌株開展發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗(yàn)。高濃度條件下不同菌株發(fā)酵性能比較結(jié)果見表2。

表2 高濃度酒精條件下不同菌株發(fā)酵結(jié)果Table 2 Fermentation results of different yeast strains under high concentration alcohol content conditions

由表2可知，菌株1308、1300及安琪干酵母的發(fā)酵性能相差不大，菌株YB-18發(fā)酵性能最強(qiáng)。菌株YB-18發(fā)酵終了時(shí)殘還原糖及殘總糖分別為0.28%、2.12%，明顯低于其他菌株；酒精度為15.65%vol，明顯高于其他菌株。菌株YB-18發(fā)酵終了醪液的外觀糖度、殘還原糖及殘總糖低，酒精度高。因此，選擇菌株YB-18為試驗(yàn)菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 糖化酶添加量對(duì)發(fā)酵的影響

隨著高濃度酒精發(fā)酵的快速發(fā)展，為了降低高糖的滲透作用，同步糖化（simultaneoussaccharifiction and fermentation，SSF）發(fā)酵模式被應(yīng)用于高濃度酒精發(fā)酵[19]。不同糖化酶添加量對(duì)酒精發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 糖化酶添加量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.1 Effectof glucoam ylase addition on fermentation results

由圖1可知，當(dāng)糖化酶添加量＜160 U/g時(shí)，對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響較大，殘總糖較高，酒精度明顯偏低，發(fā)酵不徹底?？赡苁且?yàn)樘腔讣尤肓窟^(guò)低，一方面淀粉及糊精不能完全水解，糖化不徹底，導(dǎo)致殘總糖較高；另一方面，較低的還原糖不能滿足酵母繁殖及代謝所需能量，酵母數(shù)量少且老化早，導(dǎo)致發(fā)酵不徹底。當(dāng)糖化酶添加量為160U/g時(shí)，殘總糖達(dá)到最低值2.05%，酒精度達(dá)到最高值15.53%vol，再繼續(xù)增加糖化酶用量，各檢測(cè)指標(biāo)變化很小。因此，最佳糖化酶添加量為160U/g。

2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵的影響

不同的發(fā)酵溫度對(duì)酒精發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.2 Effect o f ferm entation temperature on ferm entation resu lts

由圖2可知，發(fā)酵溫度的微小變化都會(huì)對(duì)菌株發(fā)酵能力產(chǎn)生影響。當(dāng)發(fā)酵溫度由31℃提高至36℃時(shí)，發(fā)酵終了醪液的殘總糖先降低后升高，酒精度先升高后降低高。發(fā)酵溫度過(guò)高，酵母老化較快，發(fā)酵提前結(jié)束，發(fā)酵終了殘總糖較高，發(fā)酵不徹底。溫度的升高可以提高細(xì)胞生長(zhǎng)速率，但過(guò)高的溫度卻阻礙了細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而影響了酒精的產(chǎn)量[20]。發(fā)酵溫度33℃時(shí)，殘總糖最低為2.08%，酒精度最高為15.55%vol。因此，最佳發(fā)酵溫度為33℃。

2.2.3 接種量對(duì)發(fā)酵的影響

適宜的接種量不僅有利于發(fā)酵的高效進(jìn)行，還可以保證發(fā)酵的徹底。不同的接種量對(duì)酒精發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 接種量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.3 Effect of inoculum on ferm entation results

由圖3可知，當(dāng)接種量＜20%時(shí)，殘總糖較高，酒精度偏低，說(shuō)明接種量過(guò)低，酵母數(shù)量不能在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到發(fā)酵要求的數(shù)量，導(dǎo)致發(fā)酵速率低，發(fā)酵不徹底。接種量為20%時(shí)，發(fā)酵終了殘總糖達(dá)到最低值2.02%，酒精度達(dá)到最高值15.60%vol。當(dāng)接種量＞20%時(shí)，殘總糖開始升高，酒精度開始降低，說(shuō)明接種量過(guò)高，酵母在短時(shí)間內(nèi)繁殖數(shù)量多，容易老化，不利于發(fā)酵的進(jìn)行。因此，最佳接種量為20%。

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響

不同的發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間由52 h延長(zhǎng)至68 h時(shí)，發(fā)酵終了醪液的殘總糖逐漸降低，酒精度先升高后降低。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到60 h時(shí)，殘總糖較低為2.07%，酒精度達(dá)到最大值15.58%vol，繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，殘總糖基本不變，酒精度略有下降，原因可能是發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酒精會(huì)有少量揮發(fā)。因此，最佳發(fā)酵時(shí)間為60 h。

2.2.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵的影響

不同的搖床轉(zhuǎn)速對(duì)酒精發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.5 Effect of shaker speed on fermentation results

由圖5可知，進(jìn)行適當(dāng)?shù)膿u動(dòng)有利于發(fā)酵。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速＜140 r/min時(shí)，攪拌不充分；當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速＞140 r/min時(shí)，不僅浪費(fèi)能源，還可能攜帶溶解氧進(jìn)到發(fā)酵瓶?jī)?nèi)，影響酵母厭氧發(fā)酵。隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高（80～160 r/m in），殘總糖逐漸降低，酒精度逐漸升高，說(shuō)明發(fā)酵時(shí)進(jìn)行搖動(dòng)可以使料液混合均勻，便于糖化酶更好的發(fā)揮作用，后糖化效果較好，并且防止酵母菌沉淀，使其更好的進(jìn)行酒精代謝。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到140 r/m in時(shí)，殘總糖和酒精度基本不變。因此，最佳搖床轉(zhuǎn)速為140 r/m in。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用糖化酶添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）和搖床轉(zhuǎn)速（E）5個(gè)因素為評(píng)價(jià)因素，酒精度（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行L18（35）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果及分析見表3，方差分析結(jié)果見表4。

由表3可知，影響高濃度酒精發(fā)酵因素的主次順序?yàn)锽＞A＞D＞C＞E，即發(fā)酵溫度＞糖化酶添加量＞發(fā)酵時(shí)間＞接種量＞搖床轉(zhuǎn)速，最優(yōu)組合為B2A2D2C3E3，即發(fā)酵溫度33℃、糖化酶添加量160U/g、發(fā)酵時(shí)間60 h、接種量25%、搖床轉(zhuǎn)速140 r/m in。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明發(fā)酵醪酒精度為15.95%vol。

由表4可知，糖化酶用量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其余因素對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

表3 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and ana lysis of orthogonalexperiments for fermentation conditions optim ization

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonalexperiments results

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)結(jié)果表明，影響混合原料高濃度酒精發(fā)酵因素的主次順序?yàn)榘l(fā)酵溫度＞糖化酶添加量＞發(fā)酵時(shí)間＞接種量＞搖床轉(zhuǎn)速，發(fā)酵最優(yōu)水平組合為發(fā)酵溫度33℃、糖化酶添加量160 U/g、發(fā)酵時(shí)間60 h、接種量25%、搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min，在此工藝條件下，殘總糖1.85%，酒精度15.95%vol，發(fā)酵徹底。

下一步將開展?fàn)I養(yǎng)鹽及不同輔酶對(duì)混合原料高濃度酒精發(fā)酵的影響，進(jìn)行50 L發(fā)酵罐的小型發(fā)酵試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

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Optim ization ofhigh concentration alcohol fermentation processofm ixed raw materials

LIU Yan1,LIU Yue2,KETao1*
(1.SchoolofLife Science and Technology,Nanyang NormalUniversity,Nanyang 473000,China; 2.ExperimentCenter,Henan Tianguan Group Co.,Ltd.,Nanyang 473000,China)

On thebasisof single factor experiments,the high concentration alcohol fermentation processofm ixed raw materialswasoptim ized by orthogonal experiments.The results showed that the factors affecting high concentration alcohol fermentation in orderwere fermentation temperature, glucoamylase addition,fermentation time,inoculum and shaker speed.The optimum fermentation conditionswere temperature 33℃,glucoamylase addition 160 U/g,time 60 h,inoculum 25%and shaker speed 140 r/min.Under the optimum conditions,the alcohol contentof fermentedmash was up to 15.95%vol.

m ixed raw materials;high concentration;alcohol;fermentation;optim ization

TS262.2；TS261.4

0254-5071（2017）08-0080-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.018

2017-05-05

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（152102310024）

劉燕（1984-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯镔|(zhì)能源。

*通訊作者：柯濤（1970-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樯镏扑?、生物能源與生物發(fā)酵。