李海萍

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤婦科，青海 西寧 810001)

HIF- 1α、CXCR4及VEGF在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及意義

李海萍

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤婦科，青海 西寧 810001)

目的 探究缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)- 1α及其下游基因趨化因子受體(CXCR)4、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在子宮內(nèi)膜癌組織與正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)及其意義。方法 用逆轉(zhuǎn)錄- 聚合酶鏈反應(yīng)(RT- PCR)及免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)94例子宮內(nèi)膜癌組織和30例正常子宮內(nèi)膜組織中HIF- 1α、CXCR4、VEGF mRNA及蛋白的表達(dá)情況，并分析其與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 HIF- 1α、CXCR4、VEGF mRNA及蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中存在高表達(dá)，而在正常子宮內(nèi)膜組織中幾乎無(wú)表達(dá)。HIF- 1α、CXCR4蛋白表達(dá)在正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HIF- 1α和CXCR4蛋白的表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌的脈管浸潤(rùn)、臨床分期及患者術(shù)后生存時(shí)間相關(guān)。結(jié)論 HIF- 1α、CXCR4及VEGF在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)水平增高,提示HIF- 1α可能通過(guò)調(diào)控CXCR4及VEGF蛋白的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤組織新生血管生成而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展。

子宮內(nèi)膜癌；缺氧誘導(dǎo)因子- 1α；超化因子受體- 4；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)最常發(fā)生的惡性腫瘤之一〔1〕。子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移和侵襲能力是臨床分期的重要依據(jù)，與患者的預(yù)后情況密切相關(guān)〔2〕。子宮內(nèi)膜癌屬于實(shí)體腫瘤，其發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程中有兩個(gè)不可或缺的特點(diǎn)，一是腫瘤細(xì)胞對(duì)低氧條件具有的耐受性，另一個(gè)是腫瘤組織內(nèi)新生血管的再生〔3〕。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)- 1α是哺乳動(dòng)物在低氧狀態(tài)下存在于體內(nèi)的一種異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，該因子可與缺氧反應(yīng)元件的結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，并啟動(dòng)其調(diào)控基因如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和趨化因子受體(CXCR)4的轉(zhuǎn)錄，使得VEGF、CXCR4等受其調(diào)控的基因表達(dá)水平升高，從而參與組織新生血管生成、細(xì)胞無(wú)氧代謝和遷移等活動(dòng)〔4〕。有報(bào)道指出，食管鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、口腔鱗癌、腎透明細(xì)胞癌、乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤中同時(shí)存在HIF- 1α及CXCR4高表達(dá)〔5〕，而在子宮內(nèi)膜癌惡性轉(zhuǎn)變過(guò)程中HIF- 1α及其下游靶基因的作用尚未明確。本研究通過(guò)采用逆轉(zhuǎn)錄- 聚合酶鏈反應(yīng)(RT- PCR)和免疫組織化學(xué)技術(shù)分別測(cè)量HIF- 1α、CXCR4及VEGF在子宮內(nèi)膜癌和正常子宮內(nèi)膜組織中RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，并結(jié)合患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后進(jìn)行分析。

1 資料及方法

1.1 臨床資料 參照第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》子宮內(nèi)膜癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇2010年1月至2014年4月于青海大學(xué)附屬醫(yī)院婦科手術(shù)切除子宮內(nèi)膜癌組織94例及同期因子宮肌瘤手術(shù)切取的正常子宮內(nèi)膜組織36例(經(jīng)組織病理檢查證實(shí))。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理診斷證實(shí)、隨訪資料完整、術(shù)前未行放化療。其中子宮內(nèi)膜癌組織患者年齡30～72〔平均(58.6±4.9)〕歲，正常子宮內(nèi)膜組織患者年齡36～70〔平均(51.7±3.4)〕歲。

1.2 方法

1.2.1 mRNA的檢測(cè) 石蠟標(biāo)本總RNA使用Relia- PrepTM FFPE Miniprep Systems 試劑盒進(jìn)行抽提。cDNA使用M- MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成。建立25 μl PCR反應(yīng)體系，包含1 μl上游引物(10 pmol/μl)、2 μl cDNA模板、1 μl下游引物(10 pmol/μl)、8.5 μl去離子水和12.5 μl PCR Master Mix(2倍)，引物設(shè)計(jì)由廣州伯信生物科技有限公司完成，HIF- 1α上游引物:5′- CTACTTGCCATCCTTCA- 3′，下游引物:5′- GTGGTTTTGTGGCTCTTGGTA- 3′;CXCR4上游引物:5′- TTTTGTCACCAGTTCTCTTGGA- 3′,下游引物:5′- AGCCATTATTACACACGTTCC- 3′;VEGF：上游引物:5′- TTCACTATCACAGGAGGACAC- 3′,下游引物:5′- TCCACTGAGAGGGATGAGAACT- 3′。PCR反應(yīng)條件及時(shí)間：采用ABI 2720型PCR儀，先經(jīng)過(guò)10 min 95℃預(yù)變性及1 min 95℃變性處理，而后在退火溫度下退火1 min，再在72℃下延伸1 min，經(jīng)過(guò)40個(gè)循環(huán)，最后在72℃下延伸10 min。

電泳方法(產(chǎn)物的定量測(cè)定)：將產(chǎn)物置于20 g/L的瓊脂糖(含50 g/L溴乙啶)中，電泳后對(duì)電泳帶進(jìn)行密度掃描，記錄灰度值進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

1.2.2 蛋白的檢測(cè) 采用購(gòu)自美國(guó)Abcam公司的兔抗人HIF- 1α抗體(1∶500)、兔抗人VEGF抗體(即用型)及兔抗人CXCR4抗體(1∶250)檢測(cè)HIF- 1α、VEGF及CXCR4蛋白?？雇每故罂贵w(即用型)及顯色系統(tǒng)采用Dako 公司EnVisionTM +System 試劑盒。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書執(zhí)行實(shí)驗(yàn)步驟，陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替3種一抗，抗體有效性驗(yàn)證參照已知的陽(yáng)性組織進(jìn)行。

閱片采用雙盲法。細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均著色為HIF- 1α蛋白陽(yáng)性的表達(dá)結(jié)果；細(xì)胞質(zhì)著色為VEGF及CXCR4蛋白陽(yáng)性的表達(dá)結(jié)果。觀察并將定位明確、背景清晰、有棕黃色顆粒狀染色的細(xì)胞設(shè)定為陽(yáng)性。陽(yáng)性細(xì)胞比例<10%組織面積為陰性(-)，10%～25%為弱陽(yáng)性(+)，26%～50%為中度陽(yáng)性()，>50%為強(qiáng)陽(yáng)性()。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行秩和檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 mRNA的表達(dá) 以GAPDH為內(nèi)參照。HIF- 1α、VEGF及CXCR4 mRNA在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)率分別為82例(87.2%)、65例(69.1%)和73例(77.7%)，而在正常子宮內(nèi)膜組織中分別為22例(73.3%)、5例(16.7%)、3例(10.0%)。電泳條帶顯示，VEGF、CXCR4 mRNA在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常子宮內(nèi)膜組織。見(jiàn)圖1。

圖1 HIF- 1α、VEGF及CXCR4 mRNA在不同組織中的表達(dá)

2.2 蛋白的表達(dá) 子宮內(nèi)膜癌組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜為VEGF及CXCR4蛋白的主要表達(dá)部位，正常子宮內(nèi)膜組織中HIF- 1α、VEGF及CXCR4 蛋白幾乎不表達(dá)，見(jiàn)圖2。子宮內(nèi)膜癌組織中HIF- 1α、VEGF及CXCR4 蛋白均有高表達(dá)，其中HIF- 1α及CXCR4 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率與正常子宮內(nèi)膜組織相比明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 臨床病理參數(shù)及預(yù)后與蛋白表達(dá)的關(guān)系 患者腫瘤的分化程度、組織學(xué)類型、年齡等參數(shù)與HIF- 1α和CXCR4蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)，但與子宮內(nèi)膜癌的脈管浸潤(rùn)、臨床分期明顯相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

圖2 不同子宮內(nèi)膜組織中HIF- 1α的表達(dá)(×200)

組織學(xué)類型nHIF-1α-+VEGF-+CXCR4-+子宮內(nèi)膜癌9414(14.9)23(24.5)34(36.2)23(24.5)22(23.4)16(17.0)31(33.0)25(26.6)27(28.7)22(23.4)22(23.4)23(24.5)正常子宮內(nèi)膜3027(90.0)2(6.7)1(3.3)0(0.0)12(40.0)10(33.3)5(16.7)3(10.0)25(83.3)2(6.7)2(6.7)1(3.3)Uc/P值6.760/0.0002.810/0.0054.868/0.000

表2 臨床病理參數(shù)與HIF- 1α、CXCR4、VEGF表達(dá)率的關(guān)系(n)

與Ⅲ～Ⅳ期比較：1)P<0.05；與有脈管浸潤(rùn)比較：2)P<0.05

3 討 論

近年來(lái)，女性健康意識(shí)的提高以及宮腔鏡等技術(shù)的逐漸普及使早期子宮內(nèi)膜癌及癌前病變得以及時(shí)發(fā)現(xiàn)并積極采取治療，有研究指出，早期子宮內(nèi)膜癌患者5年總生存率為98%，5年無(wú)病生存率可達(dá)93%〔6〕。對(duì)于中晚期子宮內(nèi)膜癌，尤其伴有淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，其預(yù)后較差，盡管積極采取各種治療手段包括手術(shù)治療、放化療等，其治療效果仍不理想。

研究發(fā)現(xiàn)，HIF- 1α可通過(guò)啟動(dòng)其調(diào)控基因如VEGF和CXCR4的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而參與組織新生血管生成、細(xì)胞無(wú)氧代謝和細(xì)胞增殖遷移分化等多種病理生理過(guò)程〔6～9〕。HIF- 1α在缺氧狀態(tài)下通過(guò)增強(qiáng)VEGF mRNA的轉(zhuǎn)錄活性及穩(wěn)定性，參與腫瘤組織血管的構(gòu)建〔10〕，隨著研究的深入，HIF- 1α及其下游基因CXCR4、VEGF在腫瘤發(fā)展及惡化過(guò)程中的作用越來(lái)受到關(guān)注。 Fu等〔11〕發(fā)現(xiàn)了腫瘤內(nèi)微血管密度與HIF- 1α表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中血管的形成與HIF- 1α有密切關(guān)系。邵薇薇〔12〕研究發(fā)現(xiàn)相比于正常宮頸組織，宮頸癌組織中CXCR4蛋白的表達(dá)水平明顯升高，提示CXCR4蛋白的表達(dá)水平與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系。另外，食管鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、口腔鱗癌、腎透明細(xì)胞癌、乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤中存在HIF- 1α及CXCR4高表達(dá)也同樣得到證實(shí)。

本研究結(jié)果提示缺氧可導(dǎo)致組織細(xì)胞中HIF- 1α表達(dá)水平升高，繼而通過(guò)調(diào)控VEGF及CXCR4等基因的轉(zhuǎn)錄參與子宮內(nèi)膜癌組織血管的生成、癌細(xì)胞的無(wú)氧代謝及遷移等過(guò)程，參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、惡化和轉(zhuǎn)移。通過(guò)利用調(diào)控組織細(xì)胞缺氧條件選擇性抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個(gè)新的研究方向，降低HIF- 1α表達(dá)水平可以作為治療子宮內(nèi)膜癌的方法之一。

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〔2017- 04- 11修回〕

(編輯 袁左鳴)

李海萍(1972- )，女，副主任醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤研究。

R73

A

1005- 9202(2017)15- 3782- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.062