劉 卓 趙艷晶 汪 晶 陶英歌

(牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)一科，黑龍江 牡丹江 157000)

冠心病患者血液循環(huán)miR- 126表達(dá)及與阿司匹林抵抗的關(guān)系

劉 卓 趙艷晶 汪 晶 陶英歌

(牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)一科，黑龍江 牡丹江 157000)

目的 探討冠心病(CHD)患者血液循環(huán)微小RNA(mi)- 126的表達(dá)及與阿司匹林抵抗(AR)的關(guān)系。方法 收集牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院2015 年3月至2017年1 月的CHD患者106例，選擇同期在院內(nèi)的健康體檢志愿者51例作為對(duì)照。檢測(cè)所有受試者的血小板聚集率并判斷是否存在AR，采用RT- PCR法檢測(cè)血小板的miR- 126表達(dá)，并分析miR- 126與AR的相關(guān)性。結(jié)果 與對(duì)照組比較，CHD組AR的發(fā)生率較高(P=0.005)，血小板的miR- 126明顯降低(P=0.000)。與對(duì)照組的AR和非AR(NAR)亞組比，CHD的AR和NAR亞組miR- 126水平均明顯降低(P=0.000)。結(jié)論 CHD患者血小板 miR- 126 水平低于健康人，與AR存在相關(guān)性，血小板 miR126 水平降低可能會(huì)增加健康人群發(fā)生CHD的發(fā)生。

冠心??；miR- 126；阿司匹林抵抗

臨床常采用具有抗血小板聚集的阿司匹林預(yù)防冠心病(CHD)血栓事件發(fā)生。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)不同CHD患者對(duì)于阿司匹林的治療反應(yīng)或效果存在差異，致使血栓事件發(fā)生頻繁，這種現(xiàn)象被稱為阿司匹林抵抗(AR)〔1〕。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示AR在心血管病患者的發(fā)生率高達(dá)40%。目前所發(fā)現(xiàn)的人類基因組30 億個(gè)核苷酸堿基對(duì)內(nèi)，非編碼 RNA 基因，即微小 RNA(miR) 僅占整個(gè)基因組 1%，但人類基因組中約有1/3的基因受到miR調(diào)控。miR可調(diào)控血小板內(nèi) mRNA 表達(dá)，影響血小板的活性。miR- 126〔2〕、miR- 34a〔3〕和miR- 92a〔4〕常作為血管疾病的生物學(xué)標(biāo)志，其中miR- 126與血小板的活性密切相關(guān)。本課題擬考察CHD患者血液循環(huán)miR- 126表達(dá)及AR的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并經(jīng)過(guò)患者簽署知情同意書，收集2015 年3月至2017年1 月經(jīng)WHO臨床命名標(biāo)準(zhǔn)化聯(lián)合專題組提出的《缺血性心臟病的命名及診斷標(biāo)準(zhǔn)》中對(duì)CHD的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔5〕并結(jié)合冠脈造影確診的CHD患者106例，主訴反復(fù)胸部悶痛，氣短，頭暈，時(shí)伴有心悸，疲勞時(shí)可加劇，經(jīng)休息可緩解。其中男67例，女39例，年齡(73.16±9.87)歲?；颊呔眯┝堪⑺酒チ?00 mg/d超過(guò)3個(gè)月，無(wú)胃腸出血跡象或者癥狀。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合CHD診斷標(biāo)準(zhǔn)，冠狀動(dòng)脈造影檢查提示左冠脈主干、右冠脈、左前降支和回旋支中有任意一支直徑狹窄程度>50%者；無(wú)阿司匹林過(guò)敏史者；未接受過(guò)血運(yùn)重建治療者；預(yù)計(jì)生存期>6個(gè)月；配合檢查和治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在家族或個(gè)人出血史，如原發(fā)性血小板減少性紫癜、肝膽疾病和血管硬化性出血；合并血液系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤患者；存在嚴(yán)重的肺、肝和腎功能障礙者；存在阿司匹林口服禁忌證者。選擇同期在院內(nèi)的健康體檢志愿者51例作為對(duì)照，其中男35例，女16例，平均年齡(72.65±10.32)歲。對(duì)照組在入選前2 個(gè)月內(nèi)未服用過(guò)影響血小板活性的藥物。

1.2 主要儀器及試劑 ABI QuantstudioTMDX定量PCR儀(美國(guó) ABI 公司)；5400型全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼公司)；700型全自動(dòng)血小板聚集儀(上海博士?jī)x器有限公司)；LBY- NJ4A型全自動(dòng)血小板聚集儀(北京普利生儀器有限公司)。Trizol 總RNA提取試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；內(nèi)參引物和miR- 19a(美國(guó) Invitrogen公司)，花生四烯酸(AA) (美國(guó) Invitrogen公司)。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 一般指標(biāo) 收集所有受試者的性別、年齡、體重指數(shù)、吸煙和喝酒情況，檢測(cè)血壓，抽取所有受試者空腹血5 ml，抗凝處理，離心獲得血漿，分別采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血脂和血糖及LBY- NJ4A型全自動(dòng)血小板聚集儀檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)。

1.3.2 血小板聚集率 參考血小板聚集儀說(shuō)明書及文獻(xiàn)〔6〕，收集所有受試者的空腹靜脈血5.0 ml，平均分為兩份，分別置于取2.5 ml置于抗凝管(抗凝劑∶血液=1∶9)，500 r/min離心5 min，獲得富血小板血漿，3 000 r/min離心10 min，得乏血小板血漿(PPP)。以PPP為對(duì)照，采用全自動(dòng)血小板聚集儀測(cè)定血小板聚集功能，將0.5 mmol/L AA為誘導(dǎo)劑，AA誘導(dǎo)的血小板聚集率≥20% 即為AR，20%為非CHD(NAR)。

1.3.3 RT- PCR法檢測(cè)血小板的miR- 126表達(dá) 收集所有患者的富血小板血漿，檢測(cè)血小板的miR- 126表達(dá)。血小板沉淀按miRcute miRNA 提取試劑盒提取miRNA。采用莖環(huán)引物行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：2.0 μl RT buffer，2 μmol/L Primer 0.5 μl，6.25 μl RNA，0.5 μl dNTP，0.5 μl M- MLV，0.5 μl Rnase inhibitor，RNase- Free dd H2O加入至20 μl。逆轉(zhuǎn)錄循環(huán)條件：16℃ 15 min，35℃ 60 min，80℃ 15min。 hsa- miR- 126 引物序列：正義5′- GCCCTCGTACCGTGAGTAAT- 3′，反義5′- GTGCAGGGTCCGAGGT- 3′。熒光定量PCR反應(yīng)：miRNA PCR 反應(yīng)終體積20 μl，包括2×Super Real Pre Mix 10 μl、上下游引物共 0.3 μmol/L、cDNA模板2.5 μl，同設(shè)陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)設(shè)置程序：95℃ 變性2 min，95℃變性20 s，6℃退火20 s，72℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。經(jīng)軟件分析CT值，最終結(jié)果以2-ΔCT表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行t及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般情況比較 兩組性別、年齡、體重指數(shù)、吸煙喝酒、舒張壓、血脂、血糖和血小板計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與對(duì)照組比較，CHD患者收縮壓較高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般情況比較

2.2 兩組AR發(fā)生情況 對(duì)照組出現(xiàn)AR 10例(19.61%)，CHD組出現(xiàn)45例(42.45%)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.895，P=0.005) 。

2.3 兩組miR- 126表達(dá) 對(duì)照組血小板miR- 126的相對(duì)表達(dá)(0.34±0.09)顯著高于CHD組(0.12±0.04，t=21.232，P=0.000)。

2.4 兩組AR和非AR(NAR)亞組血小板miR- 126水平比較 對(duì)照組AR亞組miR- 126水平(0.49±0.10)低于NAR亞組(0.30±0.12)，CHD組AR亞組miR- 126水平低于NAR亞組(0.14±0.04)，與對(duì)照組的AR和NAR亞組比，CHD的AR和NAR亞組miR- 126水平均明顯降低(P=0.000)。

3 討 論

血小板在CHD發(fā)生血栓栓塞事件的作用越來(lái)越明確，血小板與血管內(nèi)皮釋放的黏連蛋白結(jié)合，啟動(dòng)血栓形成，因此抗血小板治療成為CHD預(yù)防心血管事件發(fā)生的重要手段。阿司匹林是臨床最常用的抗血小板藥，病人應(yīng)用常規(guī)劑量的阿司匹林仍會(huì)發(fā)生血栓事件，即不良心血管事件(MACE)，檢查標(biāo)明血小板的活化及聚集功能未得到充分抑制，即AR現(xiàn)象，AR的發(fā)生率較高，臨床后果較嚴(yán)重，因此早期判斷患者是否存在AR，通過(guò)替換給藥方案則有望改善CHD患者預(yù)后〔7〕。本研究提示存在AR的患者如果仍然繼續(xù)使用阿司匹林，抗血小板聚集的功能降低，AR患者發(fā)生MACE的概率遠(yuǎn)高于NAR患者，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，這也是CHD患者即使接受冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)后繼發(fā)支架內(nèi)血栓的重要原因。

miR- 126的基因位于血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)基因的第7個(gè)內(nèi)含子，最早在小鼠心臟和小腦中發(fā)現(xiàn)，miR- 126可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的多種生理功能，對(duì)于造血、呼吸、消化、生殖甚至胚胎均有一定功能，尤其在心血管的功能備受關(guān)注。miR- 126在 CHD 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色〔8〕。本課題結(jié)果提示血小板miR- 126與AR呈負(fù)相關(guān)，即miR- 126水平越低，AR的發(fā)生率越高，血小板miR126的減少不僅可增加健康人發(fā)生AR的概率，也可增加健康人發(fā)生CHD的風(fēng)險(xiǎn)。本文及文獻(xiàn)報(bào)道均顯示血小板miR- 126與AR關(guān)系緊密，可用于預(yù)測(cè)人群的AR發(fā)生，尤其可用于CHD用藥指導(dǎo)〔9〕。miR- 126水平與 CHD 病變的關(guān)系較為復(fù)雜，大致可分以下4 個(gè)方面〔9〕：(1)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)參與 CHD及動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生發(fā)展，miR- 126通過(guò)直接抑制出芽相關(guān)蛋白1(SPRED1)和磷酸肌醇3激酶調(diào)控亞單位(PIK3R2)/p85- β的表達(dá)負(fù)性調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)VEGF的應(yīng)答，下調(diào)的miR- 126失去了對(duì) VEGF 的抑制，因此有學(xué)者認(rèn)為miR- 126可作為抗AS的潛在靶點(diǎn)；(2) CHD的發(fā)生起始于血管內(nèi)皮受損導(dǎo)致功能障礙，血管內(nèi)皮受自始至終伴隨在CHD發(fā)展全過(guò)程，細(xì)胞黏附因子(VCAM)- 1是參與并促進(jìn)CHD發(fā)展過(guò)程的AS早期斑塊形成的關(guān)鍵因子。VCAM- 1是miR- 126的靶基因，當(dāng)敲除miR- 126反義寡核苷酸，VCAM- 1的表達(dá)增高；(3)CHD是慢性炎癥性疾病，許多炎癥細(xì)胞和炎癥因子參與其中，miR- 126可下調(diào)腫瘤壞死因子(TNF)- α表達(dá)，抑制TNF- α誘導(dǎo)的白細(xì)胞在血管內(nèi)皮的黏附，促使動(dòng)脈斑塊面積縮小，增高膠原蛋白，達(dá)到抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生；(4)miR- 126是血管生成信號(hào)通路中的正調(diào)節(jié)因子，miR- 126可編碼類表皮生長(zhǎng)因子域(EGFL)7基因內(nèi)含子，EGFL7可編碼VEGF，因此上調(diào)miR- 126表達(dá)可促進(jìn)血管生成，改善并修復(fù)損傷血管細(xì)胞，確保血管完整，敲除斑馬魚(yú)的miR- 126可抑制血管遷移，干擾生長(zhǎng)信號(hào)，破壞血管內(nèi)膜完整性。

CHD患者血小板miR- 126與AR具有明顯的相關(guān)性，提示miR- 126可能具有促進(jìn)血小板的活化和聚集的作用，研究也顯示阿司匹林的應(yīng)用可降低循環(huán)miR- 126水平，進(jìn)一步為miR- 126參與CHD提供了證據(jù)〔10〕。雖然研究認(rèn)為在血小板表達(dá)的miR可改變血小板基因表達(dá)，如血小板內(nèi)Ago2免疫沉淀物可檢測(cè)到miR- 223，即P2Y12的 mRNA 在 3′端 UTR 可以被miR識(shí)別，miR- 223與3′ 端 UTR結(jié)合并形成 Ago2- miR- 223 復(fù)合體反過(guò)來(lái)調(diào)節(jié) P2Y12的表達(dá)〔11〕。但miR- 126對(duì)血小板基因影響尚不明確，有待進(jìn)一步探索。李娜〔12〕認(rèn)為miR- 126在穩(wěn)定型心絞痛的表達(dá)低于不穩(wěn)定型心絞痛，是否提示miR- 126在不穩(wěn)定型心絞痛水平增高是一種機(jī)體對(duì)心絞痛病理的代償性保護(hù)作用，仍需要提供更多數(shù)據(jù)支持。另外，除了miR- 126，血小板中有超過(guò)300個(gè)不同的 mRNA，這些miR均有可能不同程度地參與調(diào)控血小板基因表達(dá)，這些不同的 mRNA也存在不同程度地交互作用，如血栓素激活1 h的血小板中miR- 15a的表達(dá)下調(diào)，但miR- 365的表達(dá)上調(diào)〔3,4〕，可見(jiàn)不同的 mRNA的相互作用復(fù)雜多變，因此僅考察miR- 126或多個(gè)miRNA均可能存在不同程度的偏頗。

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〔2017- 06- 11修回〕

(編輯 袁左鳴)

陶英歌(1979- )，女，主管護(hù)師，主要從事消化內(nèi)科研究。

劉 卓(1983- )，女，主管護(hù)師，主要從事心血管疾病研究。

R741.02

A

1005- 9202(2017)15- 3707- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.028