吳良邦 吳水培 顧增輝

(杭州市解放軍117醫(yī)院骨科，浙江 杭州 310000)

BMP- 2和IGF- 1基因治療糖尿病骨折延遲愈合的作用和機(jī)制

吳良邦 吳水培1顧增輝

(杭州市解放軍117醫(yī)院骨科，浙江 杭州 310000)

目的 探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)- 2、胰島素生長因子(IGF)- 1基因治療糖尿病(DM)骨折延遲愈合的作用和機(jī)制。方法 選取6～7周齡雄性Wistar大鼠150只，分為骨折對(duì)照組、DM骨折組和治療組。利用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測各組大鼠血清中BMP- 2、IGF- 1的表達(dá)；測定各組大鼠血清中堿性磷酸酶(ALP)的含量，以判斷對(duì)成骨細(xì)胞生長的影響；利用放射免疫競爭法檢測血清中骨鈣素的含量變化；利用局部骨密度儀檢測骨折區(qū)域局部骨密度的變化情況。結(jié)果 術(shù)后前3 w，DM骨折組與骨折對(duì)照組BMP- 2、IGF- 1的濃度均呈上升趨勢，第3周達(dá)到最大值，治療組BMP- 2含量在第2周達(dá)到最大值，IGF- 1的濃度在第3周達(dá)到最大，隨后開始下降、實(shí)驗(yàn)中，治療組BMP- 2、IGF- 1的表達(dá)量最高，DM骨折組表達(dá)量始終最低。DM骨折組ALP與骨鈣素的含量始終顯著低于骨折對(duì)照組與治療組，骨折前3 w，治療組ALP與骨鈣素的含量顯著低于對(duì)照組骨折無顯著差異(P>0.05)。骨折區(qū)域局部骨密度檢測結(jié)果顯示治療組骨密度最高，骨折對(duì)照組其次，DM骨折組骨密度最低。結(jié)論 BMP- 2、IGF- 1基因通過提高DM大鼠骨折愈合過程中與成骨細(xì)胞增殖成熟相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)骨折愈合過程中骨折區(qū)域局部骨密度的增加，從而顯著改善DM骨折延遲愈合情況。

糖尿??；骨折延遲愈合；骨形態(tài)發(fā)生蛋白- 2；胰島素生長因子- 1

糖尿病(DM)會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，相較于健康人群而言，DM患者更易發(fā)生骨折，而且骨折后愈合延遲，甚至不愈合〔1,2〕。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)- 2屬于轉(zhuǎn)化因子β超家族成員，是一種多功能的分泌性蛋白〔3〕。它能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，促進(jìn)新骨形成，同時(shí)它還能促進(jìn)堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素的表達(dá)，促進(jìn)骨基質(zhì)蛋白表達(dá)，使細(xì)胞外基質(zhì)礦化，從而促進(jìn)骨細(xì)胞的成熟〔4,5〕。胰島素生長因子(IGF)- 1在骨組織的含量豐富，成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和某些間質(zhì)細(xì)胞均能合成IGF- 1，IGF- 1通過自分泌和旁分泌的方式調(diào)節(jié)骨代謝，促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞以及成骨細(xì)胞的增殖和分化，它能刺激骨鈣素和膠原蛋白的合成，促進(jìn)形成骨基質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)骨折愈合〔6～8〕。研究發(fā)現(xiàn)在骨折區(qū)域局部注射BMP- 2等生長因子能明顯加快骨折愈合的速度〔9〕，但是外源生長因子提取困難，成本較高，而且臨床上應(yīng)用時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)免疫原性引起的不良反應(yīng)。本研究旨在探討B(tài)MP- 2、IGF- 1基因?qū)Υ笫驞M骨折愈合的作用效果。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取6～7周齡雄性Wistar大鼠150只，體重200～220 g。將大鼠放于有恒溫控制條件的動(dòng)物室內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)，光照時(shí)間/黑暗時(shí)間為12 h/12 h，平均濕度50%，室內(nèi)平均溫度26℃，不限食水。飼養(yǎng)1 w后隨機(jī)將大鼠分為骨折對(duì)照組、骨折組、治療組，每組50只。

1.2 大鼠DM骨折模型制備 隨機(jī)選取100只大鼠禁食禁水12 h后腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)溶液，48 h后檢測大鼠的血糖以及尿糖含量，當(dāng)血糖含量>16.7 mmol/L，尿糖為以上時(shí)對(duì)大鼠進(jìn)行骨折手術(shù)處理，無菌條件下對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉后，鋸斷左腿脛骨，并進(jìn)行縫合固定，術(shù)后單籠飼養(yǎng)，每日注射青霉素防止傷口感染，連續(xù)注射3 d。剩下的50只大鼠腹腔注射與實(shí)驗(yàn)組相同劑量的檸檬酸鈉緩沖液，骨折處理同實(shí)驗(yàn)組。

1.3 大鼠DM骨折治療模型制備 從制備好的100只DM骨折模型中隨機(jī)選取50只大鼠制備DM骨折治療組模型，胰酶消化事先培養(yǎng)的BMP- 2和IGF- 1共轉(zhuǎn)染的骨髓瘤基質(zhì)干細(xì)胞，洗滌后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml，以每只大鼠注射0.4 ml細(xì)胞液的濃度，將細(xì)胞注入骨折局部區(qū)域制備治療模型。

1.4 血液樣品采集 造模后各組每周取一次血液樣品，連續(xù)取6 w，每次各選取6只大鼠取門靜脈血5 ml，離心后取血清置于-20℃保存。

1.5 酶聯(lián)免疫試劑盒檢測血清中BMP- 2、IGF- 1的表達(dá) 按照說明書稀釋標(biāo)準(zhǔn)液，分別設(shè)立空白對(duì)照孔、標(biāo)準(zhǔn)孔以及待測樣品孔，每孔做3個(gè)重復(fù)。空白孔不加試劑，標(biāo)準(zhǔn)孔加入50 μl稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品，待測樣品孔加入40 μl樣品稀釋液以及10 μl待測樣品，混勻后置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，去除孔中的液體，并加入稀釋過的洗滌液進(jìn)行洗滌，按照說明書要求加入酶標(biāo)試劑，混勻后置于37℃避光孵育10 min，加入終止液終止反應(yīng)。將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中檢測450 nm吸光度值，并進(jìn)行分析。

1.6 放射免疫競爭法檢測血清中骨鈣素的含量 利用骨鈣素試劑盒檢測所取樣品血清中骨鈣素的含量。將待測樣品以及標(biāo)準(zhǔn)液分別與標(biāo)記抗原加入一起進(jìn)行競爭性結(jié)合反應(yīng)，置于4℃孵育20 h，待競爭反應(yīng)達(dá)到平衡后，加入分離試劑室溫孵育15 min，離心棄上清，放射法測定沉淀物的放射性計(jì)數(shù)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析計(jì)算樣品中骨鈣素濃度。

1.7 骨密度檢測 術(shù)后連續(xù)6 w每組分別取6只大鼠進(jìn)行處死，利用局部骨密度儀檢測大鼠以骨折端為中心的2.0 mm×1.5 mm區(qū)域內(nèi)的骨密度，并進(jìn)行記錄。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清中BMP- 2的表達(dá)情況 骨折對(duì)照組與DM骨折組術(shù)后第1～3周，BMP- 2的濃度逐步上升，第3周時(shí)達(dá)到最大值，隨后3 w逐步下降，前3 w兩組有顯著差異(P<0.05)，后3 w無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。治療組在第2周濃度達(dá)到最大，隨后開始下降，但治療組與DM骨折組始終差異顯著(P<0.05)，1～4 w治療組顯著高于骨折對(duì)照組(P<0.05)，隨后2 w與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠血清中IGF- 1的表達(dá)情況 3組術(shù)后前3 w，血清中IGF- 1含量均逐步上升，第3周時(shí)達(dá)到最大值。DM骨折組和骨折對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05)，隨后3 w兩組逐步下降且無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。治療組術(shù)后第4周濃度有所下降，但與DM骨折組相比差異顯著(P<0.05)，與骨折對(duì)照組在第6周比較有顯著差異(P<0.05)。見表2。

2.3 各組大鼠血清中ALP含量比較 3組ALP的含量均隨著時(shí)間的推移逐漸降低，ALP骨折組ALP下降最快，與骨折對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，治療組顯著高于DM骨折組(P<0.05)，治療后前3 w顯著低于骨折對(duì)照組(P<0.05)，從第4周開始，治療組接近于骨折對(duì)照組，但兩組差異不明顯(P>0.05)。見表3。

2.4 各組大鼠血清骨鈣素濃度比較 前3 w 3組血清中骨鈣素的含量均隨著時(shí)間的推移均逐漸升高，在第3周達(dá)到最高值，之后開始下降。1～6 w DM骨折組與骨折對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，治療組均顯著高于DM骨折組(P<0.05)，治療后前3 w顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，但從第4周開始，治療組與對(duì)照組差異不明顯(P>0.05)。見表4。

表1 各組大鼠血清BMP- 2表達(dá)情況

與骨折對(duì)照組比較：1)P<0.05；與DM骨折組比較：2)P<0.05，下表同

表2 各組大鼠血清IGF- 1表達(dá)情況

表3 各組大鼠血清堿性磷酸酶變化情況

表4 各組大鼠血清骨鈣素變化情況

2.5 各組大鼠骨折處骨密度比較 術(shù)后大鼠的骨痂骨密度隨著時(shí)間的變化逐漸增大。在術(shù)后第1周，各組均沒有明顯差異，從術(shù)后第2周開始，DM骨折組顯著小于骨折對(duì)照組(P<0.05)，治療組顯著高于DM骨折組(P<0.05)，第2～3周治療組與骨折對(duì)照組相比無顯著差異(P<0.05)，從第4周開始，治療組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠骨折區(qū)域骨密度測定

3 討 論

DM屬于內(nèi)分泌性疾病，其發(fā)生涉及血液循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)。DM患者本身骨礦物質(zhì)較健康人含量少，而高血糖或胰島素的缺乏也容易引起骨質(zhì)疏松。

骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，骨再生需要多種細(xì)胞因子參與，例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白、成纖維細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)化生長因子、核結(jié)合因子等都對(duì)成骨細(xì)胞的增殖分化以及對(duì)骨生成的調(diào)控具有重要作用，其中BMP- 2、IGF- 1對(duì)骨折愈合作用最顯著。BMP- 2誘導(dǎo)骨髓間基質(zhì)干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，IGF- 1能促進(jìn)成骨細(xì)胞和成骨前體細(xì)胞形成骨基質(zhì)，二者在促進(jìn)新骨的形成具有重要作用〔10～12〕。本研究結(jié)果說明DM患者骨折愈合早期BMP- 2、IGF- 1表達(dá)量下降，引起骨折愈合延遲，基因治療能促進(jìn)BMP- 2、IGF- 1的表達(dá)，消除DM對(duì)骨折愈合的不利影響。血清中ALP的水平是骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志，能反映骨形成的能力，骨鈣素的表達(dá)水平反映了機(jī)體攝取鈣的能力，標(biāo)志著骨細(xì)胞的成熟，二者的表達(dá)程度間接反映了骨的形成進(jìn)程〔13，14〕。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明DM骨折愈合過程中骨的改建過程因受DM的影響而有所滯后，基因治療能恢復(fù)DM小鼠骨折愈合過程的骨改建過程。骨密度直接反映了骨質(zhì)量情況，是骨折危險(xiǎn)性的一個(gè)重要依據(jù)〔15,16〕，骨密度越高，骨質(zhì)量越好，說明基因治療能堅(jiān)強(qiáng)骨骼，顯著改善DM引起的骨質(zhì)疏松的問題，從而加快骨折愈合。本研究顯示DM導(dǎo)致的BMP- 2、IGF- 1生物活性因子含量的降低是延遲骨折愈合的重要因素，BMP- 2、IGF- 1基因治療通過提高BMP- 2、IGF- 1的含量，并改善與骨形成進(jìn)程中相關(guān)的ALP和骨鈣素的含量，提高骨密度從而加快DM大鼠骨折愈合速度，為臨床治療DM骨折延遲愈合提供理論依據(jù)。

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〔2017- 05- 11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.Y2080991)

吳水培(1951- )，男，主任醫(yī)師，主要從事創(chuàng)傷修復(fù)研究。

吳良邦(1986- )，男，碩士，住院醫(yī)師，主要從事創(chuàng)傷修復(fù)研究。

R683

A

1005- 9202(2017)15- 3678- 04；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.016

1 安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍九八臨床學(xué)院