楊化冰 張茂林 張 翀 付玉山

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430065)

補(bǔ)臟通絡(luò)方對糖尿病大鼠腎組織Ⅳ型膠原、轉(zhuǎn)化生長因子- β表達(dá)及基質(zhì)金屬蛋白酶- 9/金屬蛋白酶抑制劑- 1平衡的影響

楊化冰 張茂林 張 翀 付玉山1

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430065)

目的 觀察補(bǔ)臟通絡(luò)方對糖尿病(DM)大鼠腎組織Ⅳ型膠原(Ⅳ- C)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)- β表達(dá)及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)- 9/金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)- 1平衡的影響。方法 大鼠以脂肪乳灌胃21 d后一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg造模，后予補(bǔ)臟通絡(luò)方治療。于第8周末取左腎，測算腎重指數(shù)；SABC- FITC免疫組織化學(xué)熒光法檢測腎組織Ⅳ- C、TGF- β表達(dá)；免疫印跡法分析腎組織MMP- 9、TIMP- 1蛋白含量。結(jié)果 病理組較正常組腎重指數(shù)增加(P<0.01)，各治療組較病理組腎重指數(shù)降低(P<0.01)。病理組腎小球體積增大，系膜區(qū)擴(kuò)大病變經(jīng)治療后均有不同程度改善。病理組較正常組，腎組織Ⅳ- C、TGF- β、TIMP- 1表達(dá)增高(P<0.01)，MMP- 9表達(dá)和MMP- 9/TIMP- 1比值下降(P<0.01)；各治療組較病理組，腎組織Ⅳ- C、TGF- β、TIMP- 1表達(dá)下降(P<0.01)，MMP- 9表達(dá)和MMP- 9/TIMP- 1比值上升(P<0.01)；中、高劑量組降低TIMP- 1表達(dá)，升高M(jìn)MP- 9/TIMP- 1比值的作用優(yōu)于低劑量組(P<0.01)。結(jié)論 下調(diào)腎組織TGF- β表達(dá)，調(diào)節(jié)MMP- 9/TIMP- 1平衡，促進(jìn)膠原降解，可能是補(bǔ)臟通絡(luò)方保護(hù)DM腎臟作用的機(jī)制之一。

2型糖尿?。换|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)- 9；金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)- 1；補(bǔ)臟通絡(luò)方；Ⅳ型膠原(Ⅳ- C)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)- β

補(bǔ)臟通絡(luò)方以生黃芪與玄參為君；生曬參、麥冬、水蛭、川貝為臣；淮山藥、丹參為佐使，共奏益氣養(yǎng)陰補(bǔ)臟、祛瘀化痰通絡(luò)之功。前期研究顯示補(bǔ)臟通絡(luò)方能明顯延緩糖尿病(DM)大鼠腎組織毛細(xì)血管基底膜增厚改變，保護(hù)其腎組織〔1～3〕，然而其具體機(jī)制尚有待闡明。研究表明糖尿病腎病(DN)早期病理改變主要為腎臟肥大、腎基底膜增厚及系膜區(qū)為主的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積聚，Ⅳ型膠原(Ⅳ- C)是腎小球ECM的重要成分之一，Ⅳ- C的降解與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)- 9/金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)- 1的參與密切相關(guān)，而TGF- β被認(rèn)為是DN中導(dǎo)致ECM積聚的重要因子，并證明是MMPs/TIMPs平衡最重要的調(diào)控因子〔4～7〕。本文觀察補(bǔ)臟通絡(luò)方對DM大鼠腎組織Ⅳ- C、TGF- β表達(dá)及MMP- 9/TIMP- 1平衡的影響。

1 材料和方法

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠60只，8周齡，體重(200±20)g，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 藥物 補(bǔ)臟通絡(luò)方由生黃芪、淮山藥、丹參、玄參、麥冬、生曬參、川貝、水蛭按4∶4∶3∶3∶3∶2∶2∶1構(gòu)成，藥材購自湖北省中藥材有限公司，在湖北省中醫(yī)附院中藥房制成1 g生藥/ml、2 g生藥/ml及4 g生藥/ml水煎液。

1.3 主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司，0.1 mol/L(pH4.4) 的檸檬酸鈉- 檸檬酸緩沖液冰浴下配置成 0.5% STZ 溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。兔抗鼠Ⅳ- C多克隆抗體、兔抗鼠TGF- β多克隆抗體、兔抗鼠MMP- 9、TIMP- 1多克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，購自 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz， CA)；SABC- FITC試劑盒，購自北京中杉金橋生物科技公司；日本Olympus- CH30顯微鏡；One touch Ultra血糖測定儀，美國Johnson & Johnson公司；變性凝膠電泳和免疫印跡所用試劑及儀器，Palo Alto，CA USA和Bio- Rad (Richmond，CA，USA)。

1.4 模型的建立與分組 隨機(jī)挑選10 只大鼠作為正常組，給予正常飼料喂養(yǎng)。余下大鼠以脂肪乳灌胃21 d后一次性尾靜脈快速注射STZ 30 mg/kg，72 h后測空腹血糖(FPG)≥11.1 mmol/L者為大鼠DM模型〔8〕。成模大鼠隨機(jī)分為病理組、補(bǔ)臟通絡(luò)方低劑量組(低劑量組)、補(bǔ)臟通絡(luò)方中劑量組(中劑量組)、補(bǔ)臟通絡(luò)方高劑量組(高劑量組)。低、中、高劑量組分別給予補(bǔ)臟通絡(luò)方1、2、4 g/ml灌胃；正常組、病理組給予生理鹽水灌胃。灌胃劑量均為1 ml/100 g，1次/d。治療期間飲食不變，治療周期為8 w。

1.5 指標(biāo)的檢測 大鼠于給藥第8周末處死，打開腹腔，經(jīng)腹主動脈插管，以生理鹽水灌洗腎臟后統(tǒng)一取左腎，以電子天平稱腎臟濕重，測算腎重指數(shù)。SABC- FITC免疫組織化學(xué)熒光法檢測大鼠腎組織Ⅳ- C、TGF- β的表達(dá)：取腎組織，以4%多聚甲醛固定，浸蠟及包埋，切片(厚度為5 μm)，3%H2O2室溫孵育10 min，正常山羊血清室溫封閉20 min，滴加一抗，37℃孵育2 h，滴加二抗，37℃孵育20 min；在熒光顯微鏡下用紫外光激發(fā)，觀察標(biāo)記效果；以Image- pro plus圖像處理系統(tǒng)測平均光密度作免疫組化半定量分析。免疫印跡法分析腎組織MMP- 9、TIMP- 1蛋白含量：取腎組織樣本勻漿，BCA法進(jìn)行總蛋白濃度測定，SDS- PAGE電泳，蛋白質(zhì)以8%～10%凝膠分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1.5 h，滴加一抗4°C孵育過夜，次日滴加二抗室溫下孵育2 h，顯影、洗片、掃描；利用Photoshop軟件分析蛋白印跡條帶的灰度值，以β- actin信號值校正，設(shè)正常組灰度值為1，其他組與正常組相比取值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析及q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腎重指數(shù)的比較 病理組腎臟指數(shù)〔(6.59±0.57)mg/g〕較正常組〔(4.65±0.27)mg/g〕顯著增加(P<0.05)，低劑量組〔(5.22±0.23)mg/g〕、中劑量組〔(5.10±0.18)mg/g〕、高劑量組〔(5.13±0.14)mg/g〕腎重指數(shù)較病理組顯著降低(P<0.01)。

2.2 各組大鼠腎組織Ⅳ- C、TGF- β表達(dá)水平的比較 如圖1，圖2所示，免疫組化染色在光鏡下觀察結(jié)果：病理組與正常組相比，腎小球體積普遍增大，系膜區(qū)擴(kuò)大，與病理組相比，各治療組上述病變均有不同程度的改善。正常組在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)Ⅳ- C、TGF- β表達(dá)弱陽性，著色極淺；病理組在腎小管上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ⅳ- C、TGF- β表達(dá)強(qiáng)陽性，著色深(P<0.01)；各治療組在上述部位陽性表達(dá)(P<0.01)，見表1。

圖1 各組大鼠腎組織Ⅳ- C免疫組化染色(DAB，×100)

圖2 各組大鼠腎組織TGF- β免疫組化染色(DAB，×100)

2.3 各組大鼠腎組織MMP- 9、TIMP- 1表達(dá)及MMP- 9/TIMP- 1比值的比較 病理組較正常組TIMP- 1表達(dá)明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，MMP- 9表達(dá)和MMP- 9/TIMP- 1比值明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；各治療組較病理組TIMP- 1表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，MMP- 9表達(dá)和MMP- 9/TIMP- 1比值明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；中、高劑量組較低劑量組，TIMP- 1表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，MMP- 9/TIMP- 1比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠腎組織Ⅳ- C、TGF- β、MMP- 9、TIMP- 1表達(dá)及MMP- 9/TIMP- 1比值的比較

與病理組比較:1)P<0.01；與低劑量組比較:2)P<0.01

3 討 論

“臟虛絡(luò)痹”是臨床辨治慢性病和老年病的病機(jī)理論。痰瘀阻絡(luò)，臟氣虛損貫穿糖尿病大血管病變始終。肺脾腎氣陰兩虛為主的臟虛化生瘀痰繼發(fā)病邪，瘀痰留滯在脈絡(luò)中，日久互結(jié)并沉積于脈絡(luò)壁中，絡(luò)氣痹阻，反過來又會加重臟虛，臟虛又進(jìn)一步化生痰瘀加重絡(luò)痹，終成臟虛、絡(luò)痹的惡性循環(huán)。瘀痰形成了固定不移的脈絡(luò)之癓瘕，致使血管壁增厚，從而引發(fā)糖尿病大血管病變。補(bǔ)臟通絡(luò)基本方以生黃芪與玄參為君；生曬參、麥冬、水蛭、川貝為臣；淮山藥、丹參為佐使，共奏益氣養(yǎng)陰補(bǔ)臟、祛瘀化痰通絡(luò)之功。

MMPs是一大類能降解ECM的鋅依賴性肽鏈內(nèi)切酶家族，TIMPs為其特異性抑制劑。MMPs可以降解所有ECM成分，其中MMP- 9為明膠酶，是降解Ⅳ- C的最主要成員，TIMP- 1可特異性抑制MMP- 9的活性〔9，10〕。研究顯示TGF- β能抑制MMPs和促進(jìn)TIMPs的合成，從而減少ECM 的降解，促進(jìn)DN的發(fā)生、發(fā)展〔4～6〕。本研究結(jié)果表明，補(bǔ)臟通絡(luò)方能夠降低腎重指數(shù)，一定程度改善腎小球體積增大及系膜區(qū)擴(kuò)大等病變，對糖尿病腎臟具有保護(hù)作用。補(bǔ)臟通絡(luò)方還能夠降低DN大鼠腎組織TGF- β的過度表達(dá)，調(diào)控MMP- 9/TIMP- 1平衡。通過升高M(jìn)MP- 9表達(dá)，降低TIMP- 1表達(dá)，使MMP- 9/TIMP- 1比值上升，從而促進(jìn)腎組織Ⅳ- C降解，減少ECM 沉積，改善DN早期病變。推測，下調(diào)腎組織TGF- β表達(dá)，調(diào)節(jié)MMP- 9/TIMP- 1平衡，促進(jìn)膠原降解，可能是補(bǔ)臟通絡(luò)方保護(hù)DN腎臟作用的機(jī)制之一。

1 楊化冰,吳 勇,徐丹林,等.補(bǔ)臟通絡(luò)方對2型糖尿病腎組織保護(hù)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中醫(yī)研究,2007；20(8):14- 6.

2 楊化冰,邱幸凡.論“臟虛絡(luò)痹”是2型糖尿病基本病機(jī)〔J〕.中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2007;35(4):6- 8.

3 楊化冰,徐丹林,馬 駿.補(bǔ)臟通絡(luò)方對糖尿病大血管保護(hù)作用機(jī)制〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2014;34(21):6135- 6.

4 湯 珣.MMPs/TIMPs與腎臟纖維化〔J〕.國外醫(yī)學(xué)泌尿系統(tǒng)分冊,2001;21(增刊):149- 51.

5 王秋月.MMPs/TIMPs、TGF- β1、細(xì)胞外基質(zhì)與糖尿病腎病〔J〕.國外醫(yī)學(xué)內(nèi)分泌學(xué)分冊,2003;23(3):201- 3.

6 胡 玲.MMPs/TIMPs、TGF- β1及PKC與糖尿病腎病〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述,2005;11(12):1097- 9.

7 楊敬華.PKC- MMPs/TIMPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用〔D〕.長沙：中南大學(xué),2006.

8 龐宗然,李曉軍,劉祖涵,等.2型糖尿病合并大血管病變動物模型的建立和評價(jià)〔J〕.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2009;15(9):656- 8.

9 Oiszynski K,Zimoska M.Structure and function of matrix metalloproteinases〔J〕.Postepy Biochem,2009;55(1):76- 84.

10 陳 東,嚴(yán) 激.動脈粥樣硬化中基質(zhì)金屬蛋白酶的研究進(jìn)展〔J〕.安徽醫(yī)藥，2010;14(8):874.

〔2016- 06- 27修回〕

(編輯 曹夢園)

Effect of BuzangTongluo Decoction on the expression of Ⅳ- collagon,transforming growth factor- β and matrix metalloproteinases- 9/tissue inhibitor of matrix metalloproteinases- 1 ratio in diabetic renal tissues

YANG Hua- Bing,ZHANG Mao- Lin,ZHANG Chong,etal.

Basic Medical Sciences of Hubei University of Chinese Medicine School,Wuhan 430065,Hubei,China

Objective To study effect of BuzangTongluo Decoction on the expression of Ⅳ- collagon (Ⅳ- C),transforming growth factor (TGF)- β and MMP- 9/TIMP- 1 ratio in diabetic renal tissues and discuss the mechanism of BuzangTongluo Decoction intervening diabetic nephropathy.Methods Rats were fed with fat milk and injected with STZ 30 mg/kg to make model and treated with BuZangTongluo Decoction.Left kidney was taken at end of 8 w,then the kidney weight index was calculated and the expression of Ⅳ- C,TGF- β,MMP- 9,TIMP- 1 in renal tissues were observed with SABC- FITC immunohistochemical fluorescence and Western blot.Results After treated with BuzangTongluo Decoction,the pathological changes in glomerular volume and mesangial area were improved to some degrees compared with pathological group.Compared with normal group,the kidney weight index and the expression of Ⅳ- C,TGF- β,TIMP- 1 were increased as well as MMP- 9,MMP- 9/TIMP- 1 ratio decreased in pathological group,the differences were statistically significant (P<0.01).Compared with pathological group,the kidney weight index and the expression of Ⅳ- C,TGF- β,TIMP- 1 were decreased as well as MMP- 9,MMP- 9/TIMP- 1 ratio increased in treatment groups,the differences were statistically significant (P<0.01).Conclusions The mechanism of BuzangTongluo Decoction intervening diabetic nephropathy may be related to its regulation on the expression of TGF- β and MMP- 9/TIMP- 1 ratio to enhance collagen degradation in renal tissues.

Type 2 diabetes; Matrix metalloproteinases (MMP)- 9; Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases(TIMP)- 1; BuzangTongluo Decoction; Ⅳ collagen(Ⅳ- C); Transforming growth factor (TGF)- β

國家自然科學(xué)基金(81202733；81673867)；武漢市衛(wèi)計(jì)委臨床醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(WZ14B11)

付玉山(1968- )，男，主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治糖尿病研究。

楊化冰(1974- )，女，醫(yī)學(xué)博士，教授，主要從事糖尿病中醫(yī)病機(jī)研究。

R587

A

1005- 9202(2017)15- 3653- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.006

1 武漢市蔡甸中醫(yī)院內(nèi)科