劉燕霞 趙 敏

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，重慶 400050)

加替沙星膠聯(lián)羊膜藥膜治療細菌感染性角膜炎模型兔的療效

劉燕霞 趙 敏

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，重慶 400050)

目的 探討加替沙星膠聯(lián)羊膜藥膜治療細菌性角膜炎兔模型的效果。方法 參照常規(guī)方法制作加替沙星膠聯(lián)羊膜藥膜。新西蘭大白兔25只中隨機取5只，左眼為對照眼，右為實驗眼。待動物完全麻醉后，將制成的藥膜片覆蓋于眼球表面后揭去表層的硝酸濾紙，并用尼龍縫線間斷縫合固定于角膜緣淺層鞏膜。對照眼結(jié)膜囊內(nèi)滴入配制的3 mg/ml加替沙星溶液50 μl，并于12 h后重復(fù)滴眼一次。分別于術(shù)后和首次滴眼后1 d、2 d、3 d、4 d、5 d雙眼同時抽取房水。利用高效液相色譜法檢測實驗眼和對照眼房水中加替沙星濃度。制作金葡球菌性角膜潰瘍動物模型，將潰瘍形成后的動物分為4組，每組4只，分別為A組：生理鹽水組，B組：加替沙星滴眼液組，C組：加替沙星膠聯(lián)羊膜藥膜組，D組：單層羊膜組。取各組潰瘍愈合的兔眼作細菌培養(yǎng)，檢查各組金葡球菌性角膜潰瘍的細菌陰轉(zhuǎn)情況。取潰瘍組織石蠟包埋、切片，HE染色。同時對各組角膜潰瘍動物的療效進行判定。 結(jié)果 實驗眼各時間點房水中均可測出加替沙星，濃度0.036～0.274 μg/ml，實驗組第1、2、3天房水中加替沙星濃度與第4、5天相比明顯較高；對照眼僅在第1天和第2天檢測出加替沙星，且濃度顯著低于實驗眼(P<0.05)。角膜潰瘍，加替沙星滴眼液和藥膜均療效顯著，且藥膜在干預(yù)3 d和7 d后評分均顯著低于加替沙星滴眼液干預(yù)(P<0.05)；加替沙星滴眼液和藥膜在干預(yù)后細菌培養(yǎng)情況均出現(xiàn)一定程度的陰轉(zhuǎn)，而另外兩組僅生理鹽水干預(yù)7 d后出現(xiàn)1例陰轉(zhuǎn)。角膜切片HE染色觀察加替沙星滴眼液和藥膜干預(yù)角膜上皮及基質(zhì)有輕微水腫，炎癥細胞浸潤大量減少；加替沙星滴眼液和藥膜均療效顯著，痊愈率及好轉(zhuǎn)率分別為(75.00% vs 87.50%)和(100.00% vs 100.00%)。結(jié)論 加替沙星膠聯(lián)羊膜藥膜對金葡球菌性角膜潰瘍具有良好的治療作用，開辟了治療細菌性角膜潰瘍的另一途徑。

加替沙星膠聯(lián)羊膜藥膜；細菌性角膜炎

細菌性角膜炎是世界性的常見致盲眼病，多因細菌感染而致角膜上皮缺損及相關(guān)基質(zhì)壞死，嚴重損害視力〔1〕。目前在臨床上多以抗生素為主進行局部的抗感染治療。感染角膜的細菌對某種抗生素敏感，但該種抗生素可能會因其滲透力弱或在局部保留時間較短等原因，僅有少量的藥物透過角膜發(fā)揮藥效，其他大部分在結(jié)膜被吸收或流入鼻腔，難以達到較好的治療效果〔2〕。羊膜可促進上皮形成，抑制炎癥、減少新生血管形成，抑制纖維化〔3～5〕。纖維蛋白膠是近年來廣泛應(yīng)用于臨床手術(shù)過程中發(fā)揮止血、封閉局部組織的生物制劑，具有生物相容性、可吸收性、無毒性等特點。我室在已有的實驗基礎(chǔ)上，將加替沙星與纖維蛋白膠混合，并研究了加替沙星纖維蛋白膠的體外緩釋作用及持續(xù)抑菌作用，將加替沙星纖維蛋白膠與羊膜膠聯(lián)，制成一種新型復(fù)合生物學材料——加替沙星膠聯(lián)羊膜藥膜(GFBAM)。本文擬對GFBAM在體內(nèi)的緩釋作用進行初步的實驗研究。

1 材料與方法

1.1 一般資料 加替沙星、纖維蛋白膠、1%熒光素鈉溶液(與注射用水以1∶3的比例稀釋成0.25%濃度，避光保存待用)。新西蘭大白兔25只，雌雄不分，體重2～2.5 kg，無眼疾，均由本校動物實驗中心提供。動物手術(shù)顯微鏡：上海醫(yī)用光學儀器廠，眼科顯微器械：蘇州醫(yī)療器械廠，羊膜壓貼器：自制。

1.2 方法

1.2.1 GFBAM的制備 羊膜的制備參照Grueterich 等〔6〕方法。加替沙星膠聯(lián)羊膜的制備方法：精密稱取15 mg加替沙星，溶于2.5 ml纖維蛋白膠催化液中，并與2.5 ml纖維蛋白膠主體液分別注入混合注射器中備用。取貼載于硝酸纖維素濾紙甘油保存后的羊膜片，0.9%生理鹽水充分復(fù)水30 min，平整鋪放于超凈臺上，紗布輕拭去表面水分，噴涂槍將加替沙星纖維蛋白膠均勻噴涂于羊膜上，用自制羊膜壓貼器輕壓于表面2～3 min，確保加替沙星纖維蛋白膠與羊膜黏合緊密，制成GFBAM。大體觀察藥膜的直徑為20 mm，厚度0.1～0.3 mm，加替沙星纖維蛋白膠濃度為3 mg/ml。

1.2.2 加替沙星膠聯(lián)羊膜移植后兔房水藥物濃度測定 從25只新西蘭大白兔中隨機取5只進行實驗，左眼為對照眼(n=5)，右眼為實驗眼(n=5)。用速眠新Ⅱ(長春軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所)肌肉注射，0.15 ml/kg全麻動物，鹽酸奧布卡因滴眼液(參天制藥)實驗眼表面麻醉。術(shù)中如有必要速眠新Ⅱ可以再次給藥，給藥劑量為首次減半。待動物完全麻醉后，常規(guī)消毒鋪巾，開瞼，剪除第三眼瞼。將方法1.2.1制成的藥膜片覆蓋于眼球表面后揭去表層的硝酸濾紙，并用8/0的尼龍縫線8針間斷縫合固定于角膜緣淺層鞏膜。手術(shù)結(jié)束同時，對照眼結(jié)膜囊內(nèi)滴入3 mg/ml加替沙星溶液50 μl，并于12 h后重復(fù)滴眼一次。分別于術(shù)后和首次滴眼后1 d、2 d、3 d、4 d、5 d雙眼同時抽取房水。取樣時，采用速眠新Ⅱ肌肉注射(劑量同前)，全麻動物，取下實驗眼的藥膜，鹽酸奧布卡因滴眼液雙眼表面麻醉，于角膜緣內(nèi)9點位抽取房水0.2 ml，各組每個時間點取5只眼，所有樣品注明標號置于-20℃冰箱中冷凍保存，待測。參考丁文婷〔7〕測定房水中加替沙星的高效液相色譜法(HPLC)，檢測實驗眼和對照眼房水中加替沙星濃度。

1.2.3 金黃色葡萄球菌(金葡球菌)液的制備〔8〕實驗前2 d將4℃冰箱保存的金葡球菌接種在瓊脂平板上，置于37℃常規(guī)培養(yǎng)24 h，取一環(huán)細菌接種于2 ml肉湯培養(yǎng)基內(nèi)37℃ 8 h，再吸取1 ml菌液傳代于50 ml肉湯培養(yǎng)基內(nèi)37℃16 h，用無菌生理鹽水將細菌菌液稀釋成3×109個/ml濃度，保存于EP管中備用。

1.2.4 金葡球菌性角膜潰瘍模型制備及分組 參考1.2.2所用的麻醉方法麻醉后，用微量注射器定量將5 μl金葡球菌液注射兔的角膜中央基質(zhì)中。接種9 h后，將潰瘍形成且炎癥發(fā)展一致的兔分為4組，每組各4只，8只眼。A組：生理鹽水組，B組：加替沙星滴眼液組，C組：GFBAM組，D組：單層羊膜組。A組：予以生理鹽水滴眼，qid，每次4滴；B組：予以3 mg/ml加替沙星滴眼液滴眼，qid，每次4滴。C組：行藥膜移植術(shù)，藥膜的制備按照“1.2.1”操作，在制備藥膜時加入3 d量的加替沙星，由于加替沙星纖維蛋白膠和藥膜中藥物的釋放以1～3 d更顯著，所以每3 d更換一次藥膜。D組：在整個角膜表面覆蓋一單層羊膜并縫合固定于角膜緣淺層鞏膜。定時在干預(yù)1、3、7 d后在大體和裂隙燈下觀察角膜潰瘍情況，并參考相關(guān)文獻〔9,10〕潰瘍評分標準進行相應(yīng)的癥狀評分。

1.2.5 細菌培養(yǎng) 在干預(yù)前及干預(yù)1、3、7 d后，速眠新Ⅱ全麻后，用無菌棉簽蘸取生理鹽水后涂擦各組潰瘍兔眼角膜處，將涂擦的無菌棉簽的棉絮放入無菌試管中，蓋上軟塞，作細菌培養(yǎng)，定性判斷各組金葡球菌性角膜潰瘍的細菌陰轉(zhuǎn)情況。

1.2.6 組織病理學檢查 取各組潰瘍干預(yù)7 d后的角膜各一只，10%甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE染色。

1.2.7 療效判定 痊愈：潰瘍愈合，形成白斑，其余角膜透明，無新生血管，細菌培養(yǎng)陰性，組織病理學檢查潰瘍面角膜上皮形成，實質(zhì)層無或有個別中性白細胞浸潤。好轉(zhuǎn)：潰瘍愈合，形成灰白色混濁斑，其余角膜較混濁，有新生血管形成，細菌培養(yǎng)陽性，組織病理學檢查潰瘍面雖然形成角膜上皮，但不甚平整，實質(zhì)層有中性白細胞浸潤。無效：角膜穿孔。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用SPSS13.0軟件對各項資料進行統(tǒng)計分析，組間比較采用t或χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 加替沙星膠聯(lián)羊膜移植后兔房水藥物濃度測定結(jié)果 實驗眼各時間點房水中均可測出加替沙星，濃度0.036～0.274 μg/ml，實驗眼第1、2、3天房水中加替沙星濃度與第4、5天相比明顯較高(P<0.05)，說明藥膜在前3 d釋放較多。實驗眼在第1、2天房水中加替沙星濃度均顯著高于對照眼(P<0.05)，且對照眼在第3、4、5天的房水中已檢測不到加替沙星藥物濃度。見表1。

2.2 不同干預(yù)對模型動物角膜潰瘍的治療效果 A組和D組干預(yù)后，角膜潰瘍的癥狀評分均呈一定的增長，且D組癥狀評分均比A組高，可能與羊膜移植后眼瞼粘連嚴重而使膿液大量增加有關(guān)。而B組和C組經(jīng)干預(yù)后癥狀評分均明顯下降(P<0.05)，且C組干預(yù)3 d和7 d后評分均顯著低于B組(P<0.05)。見表2。

2.3 四組分別干預(yù)后兔眼分泌物細菌培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)率比較 B組和C組，細菌培養(yǎng)均出現(xiàn)一定程度的陰轉(zhuǎn)，陰轉(zhuǎn)率除B組干預(yù)1 d外，其他均顯著高于A組(P<0.05)；且C組的細菌培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)率高于B組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。A組和D組干預(yù)后僅A組在生理鹽水干預(yù)7 d后出現(xiàn)1例陰轉(zhuǎn)，推測可能與角膜潰瘍自行修復(fù)愈合有關(guān)。見表3。

表1 加替沙星膠聯(lián)羊膜移植后房水藥物濃度

與對照眼比較：1)P<0.05

表2 不同干預(yù)對模型動物角膜癥狀評分的影響分)

與干預(yù)前比較:1)P<0.05；與A組干預(yù)后比較:2)P<0.05；與B組干預(yù)后比較:3)P<0.05

表3 四組干預(yù)后兔眼分泌物細菌培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)率比較〔n(%)，n=8〕

與A組干預(yù)后比較:1)P<0.05

2.4 病理學檢查 A組兔眼角膜上皮及基質(zhì)層腫脹，特別是基質(zhì)的右上部位深度結(jié)構(gòu)紊亂，可能由此部位乃注射部位所致，且大量炎癥細胞浸潤，角膜上皮缺損。B組和C組的角膜上皮及基質(zhì)有輕微水腫，炎癥細胞浸潤減少，基質(zhì)較完整。D組角膜上皮及基質(zhì)層腫脹，整體深度結(jié)構(gòu)均較為紊亂，大量炎癥細胞浸潤，角膜上皮缺損。見圖1。

2.5 四組分別干預(yù)后兔細菌性角膜潰瘍的療效評價 B組、C組痊愈率及好轉(zhuǎn)率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但均要顯著高于A組(P<0.05)，主要表現(xiàn)為角膜潰瘍愈合，膿性分泌物消失，混合充血減輕，角膜水腫消退，潰瘍形成角膜白斑，其余角膜透明。A組有1例痊愈，可能是因為金葡球菌致病力弱，所以角膜潰瘍可以自行修復(fù)。D組在3 d時發(fā)現(xiàn)有大量膿液在羊膜下流動，而7 d時膿性分泌物明顯吸收減少，羊膜溶解脫落，角膜與A組相比更混濁，光滑透明度更差，故痊愈率和好轉(zhuǎn)率均低于A組。見表4。

圖1 兔角膜組織病理學切片檢查

組別痊愈好轉(zhuǎn)無效痊愈率(%)好轉(zhuǎn)率(%)A組1(12.50)3(37.50)4(50.00)12.5050.00B組6(75.00)2(25.00)0(0.00)75.001)100.001)C組7(87.50)1(12.50)0(0.00)87.501)100.001)D組0(0.00)2(25.00)6(75.00)0.0025.00

與A組干預(yù)后比較:1)P<0.05

3 討 論

細菌性角膜炎主要的致病細菌為革蘭陽性球菌和革蘭陰性桿菌。革蘭陽性球菌中的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)占較大比例〔11，12〕，革蘭陰性桿菌中的銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，P)和莫拉菌(moraxella，M)簡稱為SSPM感染。據(jù)日本橫濱大學近年來對120例細菌性角膜炎的統(tǒng)計，SSPM感染占72.5%(87例)，上述4種致病細菌分別為15%(18例)、11.7%(14例)、35.8%(43例)、10%(12例)；美國、加拿大也有同樣的統(tǒng)計結(jié)果。這種傾向不僅出現(xiàn)在工業(yè)發(fā)達國家，發(fā)展中國家也是如此。菲律賓最近對1 762例的統(tǒng)計，SSPM感染占92.2%(1 624例)，分別為4.7%(83例)、42.31%(745例)、26.6%(468例)及18.6%(328例)〔4,5〕。

體外生物力學性能實驗證明膠聯(lián)羊膜比單層羊膜具有更優(yōu)越的彈性性能、柔韌性和可塑性，有足夠的強度以承受縫合力和眼表面張力，也有一定的彈性能夠彎曲和隨眼球運動時擴張而不壓迫眼球。動物體內(nèi)實驗證明在深層角膜損傷和堿燒傷治療上，膠聯(lián)羊膜與單層羊膜相比，可以在創(chuàng)面保持更長時間以達到促進組織損傷修復(fù)的作用，因而用于眼表移植更具有優(yōu)越性。纖維蛋白膠是一種具有三維結(jié)構(gòu)的纖維蛋白多聚體，其形成的網(wǎng)架狀結(jié)構(gòu)類似一塊海綿，其中的網(wǎng)眼形成儲藥庫，隨著凝膠的纖溶和吸收，藥物緩慢釋放。由于纖維蛋白膠在體內(nèi)具有相對穩(wěn)定性，一般在1～2 w內(nèi)逐漸被機體降解吸收。這樣，纖維蛋白膠就起到暫時貯存和緩釋藥物的作用，能提高局部藥物濃度，延長藥物在局部的滯留時間〔13〕。有實驗研究證明，加替沙星對各種革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均具有較強的活性，且與頭孢唑林和妥布霉素聯(lián)合用藥相比針對潰瘍的愈合率更佳〔14,15〕，是目前治療角膜細菌感染的有效藥物之一。本研究主要對GFBAM進行了制備及部分臨床前的研究，主要結(jié)論如下：(1)將加替沙星與纖維蛋白膠混合后，與羊膜進行膠聯(lián)，可制成一種生物制品——GFBAM。(2)HPLC法顯示，隨著纖維蛋白膠的溶解，加替沙星纖維蛋白膠在體外具有緩釋作用。(3)體外抑菌試驗顯示加替沙星纖維蛋白膠具有持續(xù)抑菌作用，隨著時間的延長，抑菌作用緩慢減弱。(4)GFBAM移植到眼表后，在房水中可檢測出加替沙星濃度，說明該藥膜中的藥物能緩慢釋放并滲透到眼內(nèi)。(5)GFBAM可以作為一種眼表移植物和組織創(chuàng)傷修復(fù)的良好材料，為治療細菌性角膜潰瘍提供了另一有效途徑。

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〔2016- 05- 17修回〕

(編輯 徐 杰)

重慶市衛(wèi)生局科研資助項目(渝衛(wèi)科教2008- 2- 114)

趙 敏(1956- )，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事角膜及眼表疾病研究。

劉燕霞(1981- )，女，在讀碩士，主要從事膠聯(lián)羊膜治療角膜及眼表疾病研究。

R772.21

A

1005- 9202(2017)15- 3650- 04；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.005