雍慧娟,朱仙藝,葉小龍,馮亞敏,魯一兵,丁大法

(南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210011)

2型糖尿病合并不同程度蛋白尿患者的血清對足細(xì)胞自噬的影響

雍慧娟,朱仙藝,葉小龍,馮亞敏,魯一兵,丁大法

(南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210011)

目的：探討2型糖尿病(T2DM)合并不同程度蛋白尿患者的血清對足細(xì)胞自噬的影響。方法：選取40例T2DM患者，根據(jù)尿白蛋白與尿肌酐比值(UACR)分為正常白蛋白尿組(15例)、微量白蛋白尿組(14 例)和大量白蛋白尿組(11例)，同時選取14例正常體檢者為對照組，比較4組空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、收縮壓、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、ACR等臨床指標(biāo)。分別用各組受試者的血清處理小鼠足細(xì)胞48 h后，觀察電鏡下足細(xì)胞自噬形態(tài)、自噬蛋白LC3及凋亡蛋白Cleaved-caspase 3水平的變化。結(jié)果:與對照組比較，T2DM各組ACR、FBG、HbA1c、LDL-C、收縮壓明顯升高，HDL-C明顯降低(P<0.01)；T2DM各組ACR比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與對照組比較，T2DM各組自噬數(shù)目下降，LC3-Ⅱ表達(dá)量降低，Cleaved-caspase 3表達(dá)量增加；與正常白蛋白尿組比較，微量白蛋白尿組和大量白蛋白尿組LC3-Ⅱ表達(dá)量下降(P<0.05)，Cleaved-caspase 3表達(dá)量增加(P<0.01)；LC3-Ⅱ表達(dá)量水平與T2DM患者蛋白尿增加呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：T2DM合并不同程度蛋白尿患者的血清能降低足細(xì)胞自噬，提示患者血清中含有相關(guān)因子調(diào)控自噬，進而損傷足細(xì)胞，促進蛋白尿產(chǎn)生。

2型糖尿?。蛔慵?xì)胞；白蛋白尿；自噬；血清

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，其早期即伴隨著足細(xì)胞損傷及蛋白尿的形成。近年來，足細(xì)胞病變被認(rèn)為是DN發(fā)病機制的中心環(huán)節(jié)，也是蛋白尿產(chǎn)生的重要原因[1-2]。DN中足細(xì)胞自噬水平的抑制在足細(xì)胞病變中起重要作用，但具體機制尚不完全不清楚。臨床研究[3]表明，糖尿病患者血清中含有的細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)等各種炎癥因子能夠誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，加重蛋白尿產(chǎn)生，具體機制尚不明確。本研究擬通過在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)合并不同程度蛋白尿患者的血清中培育足細(xì)胞，旨在探討此類患者血清對足細(xì)胞自噬的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年9月至2016年9月在南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院門診就診及住院的T2DM患者40例，均符合1999年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)中關(guān)于T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除心、肝等重要器官病變；其他各種感染性疾病；未使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI)或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(angiotensin receptor blocker，ARB)類藥物。根據(jù)尿蛋白排泄率(尿微量白蛋白/尿肌酐比值，albumin-to-creatinine ratio，ACR)，將患者分成3組：正常白蛋白尿組15例(ACR<30 mg/g)，微量白蛋白尿組14例(ACR30～300 mg/g)和大量白蛋白尿組11例(ACR>300 mg/g)。正常白蛋白尿組：年齡(60.0±7.0)歲；病程(20.0±7.0)年；體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)(26.4±3.4)kg/m2。微量白蛋白尿組：年齡(58.0±9.0)歲；病程(19.0±8.0)年；BMI(27.2±2.5)kg/m2。大量白蛋白尿組：年齡(61.0±6.0)歲；病程(22.0±5.0)年；BMI(26.5±3.5)kg/m2。隨機選擇在南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院體檢健康者14例為對照組，年齡(58.0±6.0)歲；BMI(25.5±2.3)kg/m2。本研究獲得南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫審2016-59-2號)，受試者均簽署知情同意書。各組年齡、BMI比較無顯著差異(P>0.05)，可比性良好。

1.2 方法

1.2.1 血標(biāo)本采集和血清分離 所有受試者均禁食12 h后于次日晨起空腹采集肘正中靜脈血4 mL，放入不加抗凝劑的無菌離心管內(nèi)，室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心15 min(離心半徑13.5 cm)，分離血清，存于EP管中，-80 ℃低溫冰箱保存、備用。常規(guī)測定空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterin，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterin，HDL-C)；留取晨尿測定尿白蛋白及尿肌酐。

所有受試者留取靜脈血5 mL，注入無菌玻璃試管，4 ℃放置lh待其凝固后，1 500 r/min離心10 min，分離血清，分裝后保存于-70 ℃低溫冰箱中保存、備用。

1.2.3 足細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠MPC5培養(yǎng)方法參照文獻[2]。足細(xì)胞快速復(fù)蘇后用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)及γ干擾素的RPMll640培養(yǎng)液于33 ℃?zhèn)鞔鲋?，繼而接種到25 cm2培養(yǎng)瓶(3.0×105個/瓶)或六孔板內(nèi)(1.0×105個/L)，于37 ℃誘導(dǎo)分化后進行實驗。

1.2.4 透射電鏡觀察 將足細(xì)胞傳代種植于六孔板上，細(xì)胞貼壁融合達(dá)60%后，分別予以4組血清培養(yǎng)24 h，0.25%胰酶消化細(xì)胞，冰PBS洗滌2遍，收集細(xì)胞后用2.5%戊二醛固定過夜，再予1%鋨酸固定3 h，經(jīng)脫水、滲透、包埋、超薄切片、醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，在透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)下觀察。

1.2.5 Western blot法觀察足細(xì)胞蛋白表達(dá)情況 PBS洗滌細(xì)胞2次，按100∶1加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑(100+1)μL，細(xì)胞培養(yǎng)瓶刮下細(xì)胞并于冰上裂解30 min，然后4 ℃，12 000 r/min離心10 min取上清，按1/5體積加入6×上樣緩沖液，100 ℃金屬浴變性10min。應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測濃度，等量樣品(30 μg蛋白)以SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉1.5 h，加一抗(LC3抗體，美國Santa Cruz公司和Cleaved Caspase-3抗體，美國Cell Signaling Technology公司，稀釋比例1∶2 000)孵育，慢搖0.5 h后4 ℃過夜。0.5 h室溫下復(fù)溫后，1xTBST洗一抗，加辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋，美國Abbkine公司)，室溫孵育1 h，1xTBST洗二抗，加發(fā)光液后用天能凝膠成像系統(tǒng)進行圖像掃描記錄。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組臨床指標(biāo)比較

與對照組比較，T2DM各組ACR、FBG、HbA1c、LDL-C、收縮壓均明顯升高，HDL-C明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；T2DM各組ACR比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組臨床指標(biāo)比較±s)，中位數(shù)(四分位數(shù))]

*P<0.01，與對照組比較；#P<0.01，與正常白蛋白尿組比較；△P<0.01，與微量白蛋白尿組比較。

2.2 T2DM各組患者血清對足細(xì)胞自噬的影響

分別用各組受試者血清處理小鼠足細(xì)胞48 h后，觀察電鏡下足細(xì)胞自噬形態(tài)的變化。結(jié)果顯示：透射電鏡下可見典型的自噬體形成，表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)游離的單層或雙層膜結(jié)構(gòu)包裹細(xì)胞質(zhì)或損傷的細(xì)胞器形成泡狀結(jié)構(gòu)。與對照組比較，透射電鏡下可見T2DM各組患者足細(xì)胞自噬數(shù)目及體積明顯減少，且自噬數(shù)目隨著蛋白尿的增多呈逐漸下降趨勢。見圖1。

2.3 T2DM各組患者血清對足細(xì)胞自噬蛋白及足細(xì)胞凋亡蛋白的影響

分別用各組受試者血清處理小鼠足細(xì)胞48 h后，觀察足細(xì)胞自噬蛋白LC3，凋亡蛋白Cleaved-caspase 3水平的變化。結(jié)果顯示：與對照組比較，T2DM各組LC3-Ⅱ表達(dá)量下降，Cleaved-caspase 3表達(dá)量增加；與正常白蛋白尿組比較，微量白蛋白尿組和大量白蛋白尿組LC3-Ⅱ表達(dá)量均下降(P<0.05)，Cleaved-caspase 3表達(dá)量增加，差異顯著(P<0.01)。LC3-Ⅱ表達(dá)量下降與T2DM患者蛋白尿增加呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見圖2。

3 討論

DN是以白蛋白尿、腎小球肥大、腎小球濾過率降低、腎臟纖維化為特點并最終導(dǎo)致腎功能衰竭的慢性疾病。白蛋白尿為腎小球損傷的標(biāo)志物，代表著器官早期損傷，多年來被公認(rèn)為1型糖尿病和T2DM患者腎功能衰退的早期診斷指標(biāo)，以及糖尿病患者大血管、微血管的危險因素。研究[4]表明，微量蛋白尿可增加糖尿病患者終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的風(fēng)險及全因死亡率，減少蛋白尿可延緩腎功能惡化，積極控制蛋白尿可使ESRD發(fā)生風(fēng)險降低17%。然而，采用微量白蛋白尿作為早期診斷指標(biāo)仍存在很多不確定性。一項長期隨訪研究[5]發(fā)現(xiàn)，只有一部分微量白蛋白尿的糖尿病患者進一步進展為臨床腎病，而相當(dāng)一部分患者可以維持或者逆轉(zhuǎn)。更重要的是，部分患者無蛋白尿，但估算的腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)卻明顯下降。對534例1型糖尿病患者進行了平均8年的隨訪觀察，發(fā)現(xiàn)正常白蛋白尿的患者有10%出現(xiàn)早期腎功能下降(進行性eGFRcr-cys下降，至少每年3.3%)[6]。因此，以尿微量白蛋白尿作為早期DN指標(biāo)篩選，存在不確定性和變異性。

自噬能清除不正常構(gòu)型的蛋白質(zhì)，并消化受損和多余的細(xì)胞器，是真核細(xì)胞中廣泛存在的降解/再循環(huán)系統(tǒng)，在細(xì)胞新陳代謝、結(jié)構(gòu)重建、生長發(fā)育中起著重要作用[7]。自噬缺失參與的代謝性相關(guān)疾病包括糖尿病和腎病的發(fā)病過程[8]。正常情況下，足細(xì)胞具有較高的自噬活性，在DN患者和動物模型中均發(fā)現(xiàn)腎臟足細(xì)胞的自噬功能受損[9]。特異性敲除足細(xì)胞中Atg5的老齡小鼠，會發(fā)生腎小球疾病和蛋白尿，且隨著氧化應(yīng)激產(chǎn)物和泛素化蛋白內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷的積累足細(xì)胞自噬受損[10]。

作為炎性細(xì)胞因子，高糖、脂肪酸、HO-1、TNF-α等是DN的主要致病因素。但血清因子中的每一個以及其組合卻對自噬活性沒有影響，在不同的模型和細(xì)胞中作用不一樣，表明血清中其他因素可能改變足細(xì)胞中的自噬。研究[11-12]表明，部分血清因子在某種條件下可改變細(xì)胞內(nèi)信號通路和自噬活性，進一步提示與糖尿病大量蛋白尿相關(guān)的一些血清因子可能抑制足細(xì)胞自噬。為了確定這種可能性，本研究采用不同程度尿白蛋白排泄率的T2DM患者的血清來刺激小鼠足細(xì)胞，以觀察足細(xì)胞自噬的變化，結(jié)果顯示：與對照組比較，T2DM各組患者血清能明顯減少足細(xì)胞自噬的發(fā)生，且隨著蛋白尿程度的加重，足細(xì)胞自噬降低越明顯，提示不同程度的蛋白尿糖尿病患者血清里所含物質(zhì)能夠影響足細(xì)胞自噬和凋亡。關(guān)于血清中所含的重要標(biāo)志物，比如高糖、脂肪酸、HO-1、TNF-α等，需要進一步研究。此外，本研究亦發(fā)現(xiàn)，自噬不足與DN進展為大量蛋白尿有明顯的相關(guān)性，進一步補充了微量蛋白尿在診斷糖尿病腎病和糖尿病腎病的預(yù)后的不足。我們也可以探索血清相關(guān)標(biāo)志物對足細(xì)胞自噬的影響，聯(lián)合尿微量白蛋白診斷糖尿病腎病以及糖尿病腎病預(yù)后，補充因蛋白尿變異性，蛋白尿自發(fā)性降解等缺點帶來早期2型糖尿病腎病診斷的不確定性。

綜上所述，T2DM合并不同程度蛋白尿患者的血清能夠降低足細(xì)胞自噬，提示T2DM合并蛋白尿患者血清中含有相關(guān)因子調(diào)控自噬，進而損傷足細(xì)胞，促進蛋白尿產(chǎn)生。

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(學(xué)術(shù)編輯：左瑩)

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Effect of serum on podocyte autophagy in patients with type 2 diabetes mellitus complicated by different degrees of albuminuria

YONG Hui-juan,ZHU Xian-yi,YE Xiao-long,FENG Ya-min,LU Yi-bing,Ding Da-fa

(DepartmentofEndocrinology,TheSecondAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210011,Jiangsu,China)

Objective：To explore the effect of serum on the podocyte autophagy in patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM) complicated by different degrees of albuminuria.Methods：According to urinary albumin-to-creatinine ratio (UACR),40 patients with T2DM were divided into normal albuminuria group (n=15),microalbuminuria group (n=14) and macroalbuminuria group (n=11).Meanwhile,14 healthy people were selected as control group.The clinical indexes of fasting blood glucose (FBG),glycosylated hemoglobin (HbA1c),systolic blood pressure,low density lipoprotein cholesterin (LDL-C),high density lipoprotein cholesterin (HDL-C) and ACR were all compared in four groups.After the mouse podocytes were intervened 48 h by the subject serum in each group,the changes of podocyte autophagymorphology,autophagy protein LC3 and apoptosis protein Cleaved-caspase 3 levels were observed.Results:Compared with control group,ACR,FBG,HbA1c,LDL-C and systolic blood pressure were all increased,while HDL-C was decreased significantly in each group of T2DM (P<0.01).Significant differences were shown among each group of T2DM regarding the ACR (P<0.01).Compared with control group,both the number of podocyteautophagy and level of LC3-Ⅱexpression went down,whereas the level of Cleaved-caspase 3 expression went up in each group of T2DM.Compared with normal albuminuria group,the level of LC3-Ⅱexpression increased(P<0.05),while that of Cleaved-caspase3 expression decreased in both microalbuminuria and macroalbuminuria groups (P<0.01).The level of LC3-Ⅱexpression was negatively correlated with increased albuminuria in patients with T2DM (P<0.05).Conclusion:The serum in T2DM patients with different degrees of albuminuria can reduce the podocyte autophagy,suggesting that the serum in T2DM patients with different degrees of albuminuria contains relevant factors to regulate the autophagy,which can damage the podocytes and increase albuminuria.

Type 2 diabetes mellitus;Podocytes;Albuminuria;Autophagy;Serum

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.04.008

國家自然科學(xué)青年基金(H0713)；江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃(201610312013Z)

2017-03-10

雍慧娟(1985-)，女，博士，主治醫(yī)師。E-mail:yong-0503@163.com

丁大法，E-mail:dingdafa2004@aliyun.com

時間：2017-8-15 11∶26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170815.1126.016.html

1005-3697(2017)-04-0507-04

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