王陳萍　許波　蔡向明

[摘要] 目的 分別評價五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子丙素、五味子酯甲對損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用。 方法 采用過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)HL-7702肝細(xì)胞損傷模型，在五味子甲素組中，將細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、模型組及1、5、25 μmol/L五味子甲素加藥組，采用CCK-8法檢測五味子類甲素對損傷HL-7702細(xì)胞增殖力（A值）的影響，采用自動生化分析儀檢測五味子類甲素對損傷肝細(xì)胞釋放谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的影響。其余五味子乙素、醇甲、醇乙、丙素、酯甲等組與甲素組操作相同。 結(jié)果 與各自的模型組比較，五味子甲素、醇甲3個濃度組A值及AST濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），五味子醇乙、乙素、丙素的1、5 μmol/L組及五味子酯甲25 μmol/L組A值顯著提高（P < 0.05），AST濃度顯著降低（P < 0.05）。 結(jié)論 不含有亞甲二氧基的五味子甲素、醇甲對損傷肝細(xì)胞無保護(hù)作用，含有亞甲二氧基的五味子醇乙、乙素、丙素和酯甲對損傷肝細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 五味子；聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素；亞甲二氧基；活性基團(tuán)；氧化損傷；保肝作用

[中圖分類號] R286.55 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（a）-0035-04

[Abstract] Objective To evaluate the protective effects of deoxyschizandrin， schisandrin B， schisandrol A， schisandrol B， schisandrin C and schisantherin A on injured hepatocytes， respectively. Methods The H2O2 was used to induce model of injured HL-7702. In the deoxyschizandrin groups， the cells were randomly divided into normal group， model group and 1， 5， 25 μmol/L of deoxyschizandrin dosing group. The influence of deoxyschizandrin for the proliferation （A value） of injured HL-7702 was detected by cell counting kit-8， meanwhile， the influence of deoxyschizandrin for the aspartate aminotransferase （AST） released by the injured hepatocytes was detected by automatic biochemistry analyzer. The other groups of schisandrin B， schisandrol A， schisandrol B， schisandrin C and schisantherin A had the same operation with deoxyschizandrin. Results Compared with model groups， there were no significant differences of A values and AST concentration in the three concentration groups of deoxyschizandrin and schisandrol A （P > 0.05）， while the A values in 1， 5 μmol/L groups of schisandrol B， schisandrin B， schisandrin C and 25 μmol/L group of schisantherin A were increased significantly （P < 0.05）， the AST concentrations in which were decreased significantly （P < 0.05）. Conclusion Deoxyschizandrin and schisandrol A without any methylenedioxy have no protective effects for the injured hepatocytes， while schisandrol B， schisandrin B， schisandrin C and schisantherin A with the methylenedioxy have certain protective effects for the injured hepatocytes.

[Key words] Fructus Schisandrae Chinensis； Dibenzocyclooctadiene lignans； Methylenedioxy； Active group； Oxidative damage； Hepatoprotective effect

五味子類木脂素主要分布于五味子科[1]，是五味子科植物的特征性成分[2]。該科植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]和華中五味子（Schisandra sphenanthera Rehd. et Wils.）的干燥成熟果實分別作為“五味子”和“南五味子”入藥[3]。20世紀(jì)70年代，我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)五味子和南五味子具有明顯的保肝降酶作用，其活性成分主要為五味子類木脂素[4]。目前研究較多的主要有五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子丙素和五味子酯甲[5]，其中五味子醇甲、醇乙、乙素和丙素為五味子的特征性成分[6]，五味子甲素和酯甲為南五味子的特征性成分[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，五味子類木脂素保肝活性存在構(gòu)效關(guān)系[8]，一般認(rèn)為苯環(huán)上的亞甲二氧基是該類成分的重要活性基團(tuán)[9-10]。20世紀(jì)80年代，日本學(xué)者Hikino等[11]對23個該類成分進(jìn)行體外保肝活性評價，結(jié)果顯示，結(jié)構(gòu)中有2個亞甲二氧基的五味子丙素活性較強，有1個亞甲二氧基的五味子乙素、醇乙、酯甲有活性，無亞甲二氧基的五味子醇甲、甲素?zé)o活性；但同時也顯示，其中有4個成分含亞甲二氧基卻沒有活性，而不含此基團(tuán)的戈米辛J卻有活性。即目前研究結(jié)果并未完全證實亞甲二氧基是五味子類木脂素的保肝活性基團(tuán)。本研究采用過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)復(fù)制HL-7702肝細(xì)胞損傷模型，對6個代表性五味子類木脂素成分進(jìn)行保肝活性評價，以期闡明該類成分對損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用的構(gòu)效關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人肝細(xì)胞（HL-7702），購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2 藥品及試劑 五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙及五味子酯甲（產(chǎn)品批號DR20140627，純度均≥98%）購自鼎瑞化工（上海）有限公司；3%H2O2（產(chǎn)品批號1511171）購自遂成藥業(yè)股份有限公司；RPMI1640培養(yǎng)液（產(chǎn)品批號20151118）、胎牛血清（產(chǎn)品批號20150130）均購自美國Gibico公司；0.25%胰酶消化液（產(chǎn)品批號0310181503）、二甲基亞砜（DMSO，產(chǎn)品批號0201031502）、CCK-8（產(chǎn)品批號0303211504）試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.3 儀器 BBS-DDC潔凈工作臺（濟(jì)南鑫貝生物技術(shù)有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo scientific公司）；RT-6000酶標(biāo)儀（深圳雷杜公司）；AU2700自動生化分析儀（日本OLYMPUS公司）；-80℃冰箱（中科美菱公司）；SK5200H超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；Sartorius BT 25S型丟案子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理 HL-7702細(xì)胞在含有10%胎牛血清、1%雙抗（100 U/mL青霉素+100 mg/L鏈毒素）的RPMI1640培養(yǎng)基中，于5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，每2天進(jìn)行細(xì)胞換液，長至80%左右融合后以0.25%胰酶消化傳代。細(xì)胞傳至第3代后鋪96孔板及48孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在五味子甲素實驗組中，將細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、模型組及1、5、25 μmol/L五味子甲素加藥組，每組6個復(fù)孔。正常組細(xì)胞未經(jīng)任何處理；模型組每孔加入500 μmol/L的H2O2處理4 h；1 μmol/L五味子甲素加藥組每孔加入終濃度為1 μmol/L的五味子甲素預(yù)處理24 h后，繼續(xù)加入終濃度為1 μmol/L的五味子甲素及500 μmol/L H2O2組共處理4 h；5、25 μmol/L五味子甲素加藥組操作同1 μmol/L加藥組。五味子乙素、丙素、醇甲、醇乙、酯甲實驗組操作均同五味子甲素實驗組。

1.2.2 CCK-8試劑盒檢測HL-7702細(xì)胞活性 將HL-7702細(xì)胞按每孔8×104/mL、每孔100 μL均勻鋪在96孔板上，在5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后按上述分組進(jìn)行處理。處理完后每孔加CCK-8試劑10 μL，37℃孵育1 h，選擇450 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的吸光度（A）值。計算對肝損傷細(xì)胞有保護(hù)作用的實驗組細(xì)胞恢復(fù)率，細(xì)胞恢復(fù)率=（加藥組A值-模型組A值）/（正常組A值-模型組A值）×100%[12]。

1.2.3 自動生化分析儀檢測HL-7702細(xì)胞上層液中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）濃度 將HL-7702細(xì)胞按每孔1.5×105/mL、每孔200 μL均勻鋪在48孔板上，在5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后按上述分組進(jìn)行處理。收集上清液，自動生化分析儀檢測各上清液中AST濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，樣本數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析和LSD檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度五味子類木脂素成分對損傷肝細(xì)胞活力的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞增殖（A值）均明顯下降（P < 0.05），表明肝細(xì)胞損傷模型造模成功。與模型組比較，1、5、25 μmol/L五味子甲素加藥組和五味子醇甲加藥組細(xì)胞增殖活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），五味子乙素、丙素、醇乙的1、5 μmol/L組及五味子酯甲25 μmol/L組A值顯著提高（P < 0.05）。見表1。一定濃度的五味子乙素、醇乙、丙素、酯甲均能使損傷肝細(xì)胞恢復(fù)。與另兩個濃度比較，5 μmol/L的五味子乙素、丙素及醇乙作用較強（P < 0.05）；25 μmol/L的五味子酯甲作用較強（P < 0.05）。見表2。

2.2 不同濃度五味子類木脂素成分對損傷肝細(xì)胞釋放AST濃度的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞上清液中AST濃度均明顯上升（P < 0.05），表明肝細(xì)胞損傷模型造模成功。與模型組比較，1、5、25 μmol/L五味子甲素加藥組和五味子醇甲加藥組細(xì)胞上清液中AST濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），五味子乙素、丙素、醇乙的1、5 μmol/L組及五味子酯甲25 μmol/L組AST濃度顯著降低（P < 0.05）。見表3。

3 討論

肝臟在調(diào)節(jié)身體多種功能上起著至關(guān)重要的作用，包括合成、分泌和代謝等。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化作用與抗氧化作用失衡，抗氧化作用減弱，體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基（ROS）且不能及時清除，最終引起組織器官損傷的負(fù)面反應(yīng)[13]。H2O2是活性氧之一，易跨過細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)的金屬離子反應(yīng)產(chǎn)生自由基，從而進(jìn)攻細(xì)胞內(nèi)成分，如膜脂、蛋白質(zhì)、酶、核酸等，引起廣泛的氧化損傷[14]。因此，H2O2是一種用于誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化損傷最為常用的肝毒素[15]。當(dāng)H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷時，肝細(xì)胞的活力受到影響，且肝內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶會被釋放到細(xì)胞外。因此，實驗中選擇細(xì)胞增殖力和細(xì)胞上清液中AST濃度作為考察指標(biāo)。

在預(yù)實驗中，將HL-7702細(xì)胞與0.25、0.5、1、2 mmol/L的H2O2作用4 h，采用CCK-8法測定其細(xì)胞存活率依次為76%、62%、56%、52%，與正常組比較有明顯差異（P < 0.05），表明H2O2可明顯造成肝細(xì)胞氧化損傷。其中，0.5 mmol/L造成的氧化損傷相對緩和。研究發(fā)現(xiàn)，若損傷后細(xì)胞存活力過低，則細(xì)胞大量死亡，已造成不可逆性損傷[16]，表明H2O2損傷過于強烈，不利于研究細(xì)胞生物學(xué)行為改變。因此，選用0.5 mmol/L的H2O2作為HL-7702細(xì)胞氧化損傷的濃度。

本研究結(jié)果表明，五味子甲素、醇甲體外對肝細(xì)胞損傷無保護(hù)作用，而五味子乙素、醇乙、丙素及酯甲體外對肝細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用，推測這6種特征性成分的保肝活性與它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系。結(jié)構(gòu)分析可知，五味子甲素、醇甲不含有亞甲二氧基，而五味子乙素、醇乙、丙素及酯甲均含有亞甲二氧基。本研究表明，在體外實驗中亞甲二氧基可能是保肝活性的重要基團(tuán)。

20世紀(jì)70年代末80年代初，我國學(xué)者包天桐等[17]、Liu等[18]分別對從北五味子和南五味子提取得到的7種和6種木脂素進(jìn)行了小鼠體內(nèi)保肝活性評價，結(jié)果表明苯環(huán)上沒有亞甲二氧基的五味子醇甲和五味子甲素在體內(nèi)顯示了較強活性，該結(jié)果也得到了近年來的研究證實[19-20]。其原因可能是五味子類木脂素的結(jié)構(gòu)在體內(nèi)發(fā)生了代謝轉(zhuǎn)化，有研究發(fā)現(xiàn)五味子類木脂素苯環(huán)上的亞甲二氧基體內(nèi)代謝過程中可開環(huán)，相鄰的甲氧基也可環(huán)合成亞甲二氧基[21]。因此，五味子類木脂素的保肝活性構(gòu)-效關(guān)系的闡明必須基于體內(nèi)過程分析研究。有鑒于此，本課題組后期將對五味子醇甲等6個代表性五味子類木脂素成分進(jìn)行體內(nèi)保肝活性評價，并對其體內(nèi)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定，為充分利用該類化合物的保肝作用及指導(dǎo)新化合物的合成提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2017-01-16 本文編輯：張瑜杰）