吳亞楠，問(wèn)思華，武 旭，趙重博，3，劉 航，孫 靜，3*

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽(yáng) 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，咸陽(yáng) 712046；3.陜西省中藥飲片工程技術(shù)研究中心，咸陽(yáng) 712046

五味子為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實(shí)，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功效，用于久嗽虛喘、夢(mèng)遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗盜汗、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、心悸失眠的治療［1］。傳統(tǒng)用法以果實(shí)入藥［2-4］，但隨著對(duì)五味子研究的深入，發(fā)現(xiàn)五味子葉與果實(shí)所含成分相似［5-7］，有良好的利用價(jià)值。為了探討五味子葉是否有藥用價(jià)值，如何使用、如何實(shí)現(xiàn)五味子資源的合理開(kāi)發(fā)，本文對(duì)五味子葉進(jìn)行研究，通過(guò)7種成分含量的測(cè)定并與五味子果實(shí)進(jìn)行對(duì)比，為五味子葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)，同時(shí)為五味子的綜合開(kāi)發(fā)、利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2030 Plus型高效液相色譜儀（配置LC-2030 LC-2030 UV 檢測(cè)器，日本島津公司）；New Classic MS-S型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；XM-P102 H 型無(wú)極調(diào)功超聲波清洗機(jī)（昆山超聲儀器有限公司）；0.22μm 微孔濾膜（天津杉羽科技有限公司）；UPL-10L 型超純水機(jī)（四川卓越水處理有限公司）。

1.2 試藥

五味子、五味子葉由柞水縣世紀(jì)生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供，經(jīng)孫靜教授鑒定為木蘭科植物五味子的果實(shí)與葉。五味子甲素（批號(hào)PS000928，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.02%），五味子乙素（批號(hào)PS010450，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.62%），五味子丙素（批號(hào)PS020290，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.62%），五味子醇甲（批號(hào)PS011670，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.90%），五味子醇乙（批號(hào)PS010166，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.83%），五味子酯甲（批號(hào)PS000936，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.55%），五味子酯乙（批號(hào)PS010169，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.16%），均購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司；乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）。流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B）。梯度洗脫：0～20 min，45%～55% A；20～30 min，55%～60% A；30～40 min，60%～65% A；40～60 min，65% A；60～70 min，65%～75% A；70～80 min，75%～85%A；80～90 min，85%～95%A；90～100 min，95%～100%A）。流速：0.5 mL·min－1。檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。柱溫：40℃。進(jìn)樣量：10μL。

2.2 供試品溶液的制備

取五味子果實(shí)、葉樣品粉末（過(guò)3號(hào)篩）約0.3 g，精密稱(chēng)定，置于25 m L 量瓶中，加甲醇約20 m L，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率20 k Hz）20 min，取出，加甲醇至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得［1］。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取各對(duì)照品適量，置于10 m L 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成五味子丙素、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素質(zhì)量濃度約為0.1 mg·m L－1的混合對(duì)照品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密稱(chēng)定五味子甲素、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素約10 mg，分別置于1 m L 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成高質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液。精密吸取各高質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，置于5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成各對(duì)照品質(zhì)量濃度為1 mg·m L－1的混合對(duì)照品溶液。再逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.002 mg·mL－1的混合對(duì)照品溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取質(zhì)量濃度為0.002 mg·mL－1的混合對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)謩e以信噪比（S／N）為3和10 時(shí)的對(duì)照品質(zhì)量濃度為檢測(cè)限（limit of detection，LOD）和 定 量 限（limit of quantitatio，LOQ）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測(cè)限和定量限Tab.1 Regression equation，correlation coefficient，linear range，LOD and LOQ for each component

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙峰面積 的RSD 值 分 別 為0.27%、0.25%、0.29%、3.00%、0.62%、0.29%、0.28%。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別精密稱(chēng)取五味子果實(shí)、葉各6 份，每份約0.3 g，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。五味子果實(shí)中五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙質(zhì)量濃度的RSD 值分別為2.71%、0.92%、0.51%、0.38%、0.74%、0.55%、1.23%。五味子葉中五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙質(zhì)量濃度的RSD 值分別為0.64%、0.88%、0.8%、1.17%、0.86%、0.54%、0.47%。表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

分別取五味子果實(shí)、葉供試品溶液，分別在、2、4、6、8、10、12、24、48 h進(jìn)樣分析。五味子果實(shí)中五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙質(zhì)量濃度的RSD 值 分 別 為0.15%、0.43%、2.15%、1.34%、0.29%、0.33%、0.52%。五味子葉中五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 值分別 為0.98%、0.56%、2.86%、1.35%、2.13%、1.22%、0.32%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

分別精密稱(chēng)取已知成分含量的五味子果實(shí)、葉樣品粉末，各6份，每份約0.15 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入各對(duì)照品適量，按照2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表2 五味子果實(shí)加樣回收率結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests of Schisandra fruits

表3 五味子葉加樣回收率結(jié)果Tab.3 Results of recovery tests of Schisandra leaves

2.9 含量測(cè)定

取五味子果實(shí)、葉，按照2.2項(xiàng)下方法制樣，按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子醇甲、五味子醇乙的含量。結(jié)果見(jiàn)表4?；旌蠈?duì)照品、五味子果實(shí)、葉色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms

表4 各成分含量Tab.4 Content of each composition

3 討論

實(shí)驗(yàn)分別考察了將甲醇和乙腈作為流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響，結(jié)果顯示，乙腈-水分離系統(tǒng)的分離效果好，最終確定以乙腈-水分離系統(tǒng)作為流動(dòng)相；考察不同梯度流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響，確定最佳流動(dòng)相梯度，但有2個(gè)化合物分離效果不好。

通過(guò)對(duì)柱溫進(jìn)行調(diào)整，結(jié)果顯示，在柱溫為40℃時(shí)，分離效果最好，確定以此條件進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

五味子具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功效，具有很好的保健開(kāi)發(fā)潛力，其中五味子甲素、五味子酯甲具有保肝、抗炎的功效［8-10］，五味子乙素具有抗炎、抗氧化的作用［11-16］，五味子丙素、五味子酯甲具有調(diào)節(jié)肝臟藥物代謝的作用［17-19］，五味子醇乙具有保肝的作用［20-21］。通過(guò)對(duì)7種成分含量的測(cè)定可知五味子果實(shí)與葉的化學(xué)成分相似，但含量相差懸殊，可見(jiàn)五味子葉的藥用價(jià)值較低，僅可作為保健品開(kāi)發(fā)使用。