覃軍　鄧廣海　陳艷紅

[摘要] 目的 優(yōu)化嶺南特色飲片炮天雄總生物堿的提取工藝。 方法 采用響應(yīng)面分析法，依據(jù)Box-Behnken原理優(yōu)化炮天雄乙醇超聲提取工藝，實(shí)驗(yàn)以總生物堿提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察提取時(shí)間、乙醇濃度、液料比等主要影響因素，最終得出炮天雄最佳提取工藝。 結(jié)果 炮天雄總生物堿最佳提取工藝為乙醇比例75%，液料比8.0，提取時(shí)間30 min，在此條件下，總生物堿提取率理論值為31.1%，實(shí)際值為32.5%。 結(jié)論 基于響應(yīng)面法優(yōu)化的參數(shù)條件具有較高的實(shí)用價(jià)值，可為嶺南特色炮天雄的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 炮天雄；響應(yīng)面法；總生物堿；工藝優(yōu)化

[中圖分類號(hào)] R961 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）07（a）-0031-04

[Abstract] Objective To optimize extraction process of total alkaloids from Lingnan featured pieces Paotianxiong by response surface method. Methods Three-variables as extraction time， ratio of material to solution and ethanol concentration， and three-levels Box-Benhnken experimental design was used to optimize the effects of independent variables on the total alkaloid extraction efficiency. Results The optimum conditions were extraction time 30 min， ratio of material to solution 8.0， and 75% ethanol concentration. Under the optimum conditions， the theoretical total alkaloid extraction rate was 31.1%， and the actual rate was 32.5%. Conclusion Response surface method is an effective methodology to optimize the total alkaloid extraction process of Lingnan featured pieces Paotianxiong.

[Key words] Paotianxiong； Response surface method； Total alkaloid； Process optimization

附子為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaeli debx.）的子根，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為子根中獨(dú)生個(gè)大者稱之為天雄[1]，嶺南地區(qū)根據(jù)傳統(tǒng)用藥習(xí)慣，采用傳統(tǒng)炮制技術(shù)將其加工成獨(dú)具嶺南特色炮制品，習(xí)稱炮天雄[2]。炮天雄在嶺南地區(qū)具有廣泛臨床應(yīng)用基礎(chǔ)，在港澳、東南亞地區(qū)，炮天雄常作為滋補(bǔ)食療上品，用于治療元陽素虛、腎虧陽虛證患者[3-5]。現(xiàn)代研究表明，炮天雄富含生物堿類成分[6-8]，這類成分為炮天雄的主要藥效成分，因此從炮天雄分離提取生物堿類成分具有較高的現(xiàn)實(shí)意義。目前，嶺南特色炮天雄生物堿成分提取工藝的研究未見報(bào)道。響應(yīng)面法（RSM）是一種優(yōu)化多變量體系的有效實(shí)驗(yàn)工具，采用多元二次回歸方程來擬合多個(gè)因素與響應(yīng)值之間、因素與因素之間的函數(shù)關(guān)系，找出各因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，有效地解決多變量問題[9-12]。由于響應(yīng)面分析法在優(yōu)化研究中具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、精確度高、成本低、產(chǎn)出高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于生物、化學(xué)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[13-16]。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面方法，以總生物堿提取率為響應(yīng)值，考察不同提取時(shí)間、乙醇分?jǐn)?shù)、液料比等主要提取因素及它們的相互作用對(duì)總生物堿提取率的影響，優(yōu)化炮天雄提取工藝。

1 材料

KQ-2200B型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BS110S型電子天平（賽多利斯有限公司）；HWS28型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；炮天雄飲片（批號(hào)：YPA00001）購于廣州市藥材公司，經(jīng)廣東省中醫(yī)院林華主任中藥師鑒定為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaeli debx.）的干燥根的炮制品。乙醇、氯仿等試劑均為分析純（廣州化學(xué)試劑廠），水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備

取樣品粉末（過三號(hào)篩）100 g，精密稱定，按照響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案進(jìn)行提取，回收提取液，濃縮，用1%鹽酸水溶劑定容至含藥材0.5 g/mL供試品液，2℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 總生物堿測定

參照2010版《中國藥典》[17]一部附子項(xiàng)下總生物堿含量測定及相關(guān)文獻(xiàn)，采用滴定法測定炮天雄總生物堿含量。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)炮天雄乙醇超聲提取工藝中乙醇體積、固液比、提取時(shí)間等主要影響因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平，以總生物堿提取率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)[18-19]。實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。

實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，選取提取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取液料比（B）、提取時(shí)間（C）三因素三水平對(duì)總生物堿提取率的影響。實(shí)驗(yàn)按照Design-Expert設(shè)計(jì)方案設(shè)計(jì)了15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)平行分析3次，結(jié)果見表2。15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)可分為2類，包括12個(gè)析因點(diǎn)和3個(gè)零點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

通過對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，利用Design-Expert軟件對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸擬合后，得到3個(gè)因素與炮天雄生物堿含量之間的模擬方程為：Y = 29.03+4.15A+0.62B+2.98C-0.35AB-0.95AC-1.20BC-2.17A2-3.32B2-2.62C2。

為考察回歸方程的有效性及各因素對(duì)總生物堿提取率的影響程度，對(duì)上述回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由此可看出，該回歸模型的F檢驗(yàn)為極顯著（P < 0.01），其失擬項(xiàng)為不顯著（P > 0.05），表明該二次多項(xiàng)模型可以較好地描述各因素與響應(yīng)值的真實(shí)關(guān)系，可用于總生物堿最佳提取工藝的篩選。該回歸方程的相關(guān)系數(shù)為R2 = 0.9657，即96.57%的數(shù)據(jù)可用該模型解釋，方程擬合度良好。單因素A、C及二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)響應(yīng)值有顯著影響（P < 0.05），其中單因素A、C和二次項(xiàng)A2、C2對(duì)響應(yīng)值有極其顯著影響（P < 0.01）。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化工藝分析

為了進(jìn)一步研究各因素之間的交互關(guān)系，采用Design-Expert軟件模擬了3種影響因素對(duì)總響應(yīng)因子交互影響的3D響應(yīng)曲面圖和等高線圖（圖1～3），分別將其中1個(gè)因素固定在零水平，考察另外兩個(gè)因素之間的交互影響。在等高線圖中，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，在響應(yīng)曲線圖中，曲線走勢越陡，其影響越顯著，曲線走勢越平滑，其影響越小。

乙醇體積分?jǐn)?shù)比和液料比對(duì)炮天雄總生物堿提取率的影響見圖1，在提取時(shí)間固定為零水平（30 min）時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)炮天雄生物堿提取率影響顯著，隨著乙醇濃度增加而逐步增加，在乙醇濃度40%～70%時(shí)增加尤為明顯，液料比的曲線較為平緩，在1∶9附近達(dá)到最高點(diǎn)，表明其對(duì)提取率影響相對(duì)較小。等高線圖表明兩者交互對(duì)提取率影響不顯著。

固定液料比為1∶8時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)生物堿提取率的影響見圖2。從圖2A可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間對(duì)提取率影響較為顯著，生物堿提取率隨著乙醇濃度和提取時(shí)間的增加而增加，其增幅逐步收窄。從3D曲線圖的曲面分析和高線圖直觀分析，可見兩者交互影響比較明顯。

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，液料比與提取時(shí)間對(duì)生物堿提取率的影響見圖3。從3D曲面圖直觀分析可知，提取時(shí)間對(duì)生物堿提取率影響較大，而液料比影響因素相應(yīng)的曲線較為平緩。兩者的交互作用也不明顯。

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行最優(yōu)化分析，確定最佳提取的生物堿提取條件為乙醇比例76.6%，液料比8.0，提取時(shí)間30.7 min，在此條件下生物堿的理論提取率為31.1%。

2.5 工藝驗(yàn)證

采用模型預(yù)測的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際應(yīng)用情況，定義修正后的最優(yōu)提取條件為乙醇比例75%，液料比8.0，提取時(shí)間30 min，按此工藝提取3次，得到生物堿平均提取率為32.5%，略高于理論值31.1%。

3 討論

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化嶺南特色藥材品種炮天雄的總生物堿提取工藝最佳條件為乙醇比例76.6%，液料比8.0，提取時(shí)間30.7 min。根據(jù)實(shí)際情況修訂提取參數(shù)為乙醇比例75%，液料比8.0，提取時(shí)間30 min。在此條件下得到生物堿最佳提取率為32.5%，與理論值31.1%相近，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的生物堿提取參數(shù)條件可靠，可為炮天雄生物堿提取擴(kuò)大化生產(chǎn)和綜合利用提供了實(shí)驗(yàn)參考和依據(jù)。

過往的研究較多采用單因素考察法和正交實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)選總生物堿提取效率[20]。與正交實(shí)驗(yàn)方法相比，響應(yīng)面法通過構(gòu)建二次回歸數(shù)學(xué)模型，能分析多因素干擾下實(shí)驗(yàn)設(shè)置水平之外的最佳水平組合。但響應(yīng)面法優(yōu)化的前提是，對(duì)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)應(yīng)包括最佳實(shí)驗(yàn)條件在內(nèi)，如實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)點(diǎn)選取不當(dāng)，很難得到最優(yōu)化的結(jié)果。縱然如此，響應(yīng)面法不失為研究多因素問題的有效工具。本文通過響應(yīng)面方法技術(shù)應(yīng)用，為更多中藥及相關(guān)研究工作者利用該技術(shù)方法，有效解決工作中的方法設(shè)計(jì)等問題提供研究思路和應(yīng)用案例。

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（收稿日期：2017-03-14 本文編輯：李亞聰）