穆開朗，程昆木,王 錦

(安康學(xué)院 秦巴中藥資源研發(fā)中心,化學(xué)化工學(xué)院，陜西 安康 725000)

木蘭科植物五味子分為南五味子和北五味子兩種[1]，是臨床常用中藥，有收斂、益氣、寧心的功效[2～4]。五味子果實(shí)是五味子藥材的主要藥效部位，并且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高。目前，五味子在眾多行業(yè)被廣泛應(yīng)用，如醫(yī)藥、食品、飲料、酒、保健品等[5]，市場(chǎng)需求量不斷增加，五味子的種植面積也不斷擴(kuò)大。但是人工栽種的五味子在種植過(guò)程中，為了提高五味子的產(chǎn)量和品質(zhì)，需要每年對(duì)藤莖進(jìn)行人工修剪，一般剪下枝條的重量相當(dāng)于原藤的1/3～1/4。然而修剪后的五味子藤莖常常作為廢料丟棄，或取莖條用于調(diào)味，未能做進(jìn)一步開發(fā)利用[6]?，F(xiàn)代研究證明五味子藤莖中存在多種生物活性良好的五味子素類化合物[7～8]。在古今用藥時(shí)，由于存在南五味子和北五味子不分辨用藥或一起混用的情況，為了避免互混、互代、以假充真的現(xiàn)象，常常需要對(duì)南、北五味子進(jìn)行鑒別用藥。五味子藤莖作為五味子種質(zhì)開發(fā)應(yīng)用的新方向，近年來(lái)也成為眾多藥材研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。此前，宋靜賢等[9]采用高效液相色譜法測(cè)定北五味子藤莖超臨界提取物中五味子甲素、五味子乙素以及五味子醇甲的含量。魏忠寶等[10]采用HPLC法測(cè)定五味子根、藤莖及葉不同溶劑提取物中五味子甲素、乙素的含量?，F(xiàn)存研究大多在對(duì)北五味子藤莖的研究，且集中在對(duì)其提取物藥理活性的研究，而對(duì)南北五味子藤莖中主要藥效成分五味子素的差異鮮見報(bào)道。

筆者實(shí)驗(yàn)優(yōu)選南北五味子藤莖中優(yōu)質(zhì)種質(zhì)藤莖，以五味子酯甲和五味子乙素含量為考察五味子素含量的指標(biāo)，采用HPLC法測(cè)定其含量，再通過(guò)對(duì)差異的比較分析，以期為準(zhǔn)確開發(fā)利用南北五味子藤莖提供理論依據(jù)與參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

FW177型中草藥粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；高效液相色譜儀LC-10ATvp，日本島津；電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。KQ2200E超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；FA2014型精密分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；Molbiochem 520超純制水機(jī)，重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司。

1.2 材料和試劑

南五味子及其藤莖采自陜西商洛、陜西安康、湖北、福建福州、甘肅隴南等地；北五味子及其藤莖采自陜西西安、陜西漢中、遼寧撫順以及吉林長(zhǎng)白山等地。甲醇和無(wú)水乙醇使用色譜純，95%乙醇使用分析純，購(gòu)自天津天力化學(xué)試劑有限公司。五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司。五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，實(shí)驗(yàn)室自制三重蒸餾水。

1.3 樣品的前處理

將采集的五味子藤莖清洗干凈，除去表面泥沙，晾干，于60℃烘干，粉碎，過(guò)16目篩后存于干燥器中，備用。

2 方法與結(jié)果分析

2.1 色譜條件

采用Kromasil-C18( 4.6 mm ×200 mm，5 mm) 色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-水(V甲醇：V水=75:25)，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL，柱溫為30℃。經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)結(jié)合發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相采用甲醇-水(75∶25，體積比)時(shí)，五味子乙素和五味子酯甲色譜峰出峰較好且不受相鄰峰干擾。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取五味子酯甲8.1 mg，五味子乙素6.6 mg，置于50 mL容量瓶中加乙醇溶解，配制成0.162 0 mg/mL的五味子酯甲對(duì)照品，0.132 0 mg/mL的五味子乙素對(duì)照品。將兩種對(duì)照品各吸取1 mL配成混合對(duì)照品，過(guò)0.45 μm濾膜。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取各個(gè)樣品粉末3.000 0 g放置在100 mL具塞錐形瓶中，加入95%乙醇45 mL，超聲處理( 功率100 W)3次，每次20 min，取出，放冷，搖勻，過(guò)濾到50 mL容量瓶中，用95%乙醇定容。

2.4 線性關(guān)系考察

混合對(duì)照品溶液進(jìn)一步稀釋，得五味子酯甲0.032 4 mg/mL，0.064 8 mg/mL,0.097 2 mg/mL,0.129 6 mg/mL,0.162 0 mg/mL不同濃度和五味子乙素0.026 4 mg/mL,0.052 8 mg/mL,0.079 2 mg/mL,0.105 6 mg/mL,0.132 0 mg/mL 不同濃度的5個(gè)混合對(duì)照品溶液系列。按照“2.1”下的條件測(cè)定峰面積。將對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)(單位mg/mL)，將峰面積作為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，計(jì)算五味子酯甲和五味子乙素的回歸方程和線性范圍。擬合得五味子酯甲工作曲線方程Y=2*107X-10 423，R2=0.998 9；五味子乙素工作曲線方程Y=2*107X-153 192，R2=0.999 1。表明五味子酯甲濃度在0.032 4～0.162 0 mg/mL，五味子乙素濃度在0.026 4～0.132 0 mg/mL內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

圖1 五味子標(biāo)準(zhǔn)溶液和部分供試溶液的HPLC圖譜

圖2 五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照溶液5 μL，根據(jù)“2.1”檢測(cè)條件下連續(xù)進(jìn)樣總共測(cè)定6次，記錄出五味子酯甲的峰面積，并計(jì)算得RSD為0.87%，說(shuō)明了這種方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取湖北恩施五味子藤莖樣品粉末6份，根據(jù)2.3下的方法制備供試溶液，根據(jù)“2.1”下的檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)定，并記錄峰面積，計(jì)算出五味子酯甲含量，得到湖北恩施五味子藤莖平均含量為0.37%，計(jì)算出RSD為0.95%，說(shuō)明了這種方法重復(fù)性好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取吉林長(zhǎng)白山五味子藤莖供試溶液，每隔2 h進(jìn)樣5 μl，根據(jù)“2.1”下的檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)定6次，并記錄峰面積，計(jì)算出RSD為1.20%，說(shuō)明了供試溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量的遼寧五味子藤莖樣品 6份，加入一定量的混合對(duì)照品，根據(jù)“2.3”下的方法制備加樣供試品溶液。各種成分的加樣回收率和 RSD 分別為：五味子乙素98.73%和1.33%、五味子酯甲 103.64%和2.60%。

表1 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

2.9 樣品含量的測(cè)定

取用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后的供試溶液，根據(jù)“2.1”下的檢測(cè)條件進(jìn)樣測(cè)定，并記錄峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算出五味子乙素和五味子酯甲的含量。南北五味子藤莖中五味子素(五味子酯甲、五味子乙素)，五味子酯甲和五味子乙素在南北地區(qū)五味子藤莖中均有分布，南五味子藤莖中五味子酯甲含量略高于北五味子藤莖，北五味子藤莖中五味子乙素含量高于南五味子藤莖，見表2。

表2 不同地區(qū)南北五味子藤莖中各成分含量 (mg/g)

3 討論與結(jié)論

3.1 南五味子藤莖和北五味子藤莖中均含有豐富的五味子素類化合物

此前大多研究集中在對(duì)中藥材五味子果實(shí)成分、配伍、有效成分藥理活性等方面[11～13]，而對(duì)南五味子和北五味子藤莖的相關(guān)研究較少，對(duì)南五味子藤莖和北五味子藤莖中主要藥效成分五味子素類化合物更是鮮見報(bào)道。五味子素作為五味子藥材的主要藥效成分，其是否也存在五味子藤莖中，是我們開發(fā)利用五味子藤莖的前提。由本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知五味子酯甲在南五味子藤莖中含量為0.237%，在北五味子藤莖中含量為0.100%；五味子乙素在南五味子藤莖中含量為0.028%；在北五味子藤莖中含量為0.147%。證明了不論是南五味子藤莖還是北五味子藤莖中均含有五味子素類化合物，這與任海英、劉葉[14～16]等人在不同品種、產(chǎn)地從五味子藤莖中發(fā)現(xiàn)五味子素類化合物的結(jié)果一致，并且更加綜合的考察了南北地區(qū)五味子藤莖中五味子素含量。這一發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步開發(fā)利用五味子藤莖，探究提取五味子素類化合物的工藝提供了必要前提與理論依據(jù)。

3.2 兩種五味子素類化合物在南北地區(qū)五味子藤莖中的分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

在傳統(tǒng)用藥時(shí)，因北五味子果實(shí)療效優(yōu)于南五味子果實(shí)，故而一般藥用五味子就默認(rèn)指北五味子。北五味子療效優(yōu)，主要是北五味子果實(shí)中有效成分五味子素含量較高的緣故[17～20]。要開發(fā)利用五味子藤莖，明確南北地區(qū)五味子藤莖中五味子素含量的差異是必要的。筆者研究結(jié)果表明，五味子酯甲與五味子乙素在南五味子藤莖和北五味子藤莖中表現(xiàn)出了一定的趨向性，即五味子乙素在北五味子藤莖中含量較高，五味子酯甲在南五味子藤莖中含量較高，這和我國(guó)南北地區(qū)氣候、環(huán)境、溫度及降水等差異密切相關(guān)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，開發(fā)利用五味子藤莖，需要五味子乙素含量高的則選擇北五味子藤莖，需要五味子酯甲含量高的南五味子藤莖更加經(jīng)濟(jì)合宜。

3.3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)我們以超聲輔助醇溶液提取五味子藤莖中兩種五味子素，采用HPLC法檢測(cè)收集到的9種南五味子藤莖和北五味子藤莖，發(fā)現(xiàn)了南五味子藤莖和北五味子藤莖中均含有豐富的五味子素類化合物，且兩種五味子素類化合物在南北地區(qū)五味子藤莖中的分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這兩類五味子素在南五味子藤莖和北五味子藤莖中表現(xiàn)出了一定的趨向性，即五味子乙素在北五味子藤莖中含量較高，五味子酯甲在南五味子藤莖中含量較高，這和南北地區(qū)環(huán)境差異有很大關(guān)系。因而在開發(fā)利用五味子藤莖中五味子素類成分，以五味子乙素類化合物為主，則可考慮北五味子藤莖；以五味子酯甲類化合物為主，則可考慮南五味子藤莖。筆者以中藥材五味子中主要藥效成分五味子素類化合物為研究對(duì)象，以五味子乙素和五味子酯甲兩種五味子素含量為指標(biāo)，對(duì)收集到的9種南五味子藤莖和北五味子藤莖樣品進(jìn)行含量測(cè)定與差異分析。雖然本次研究中選取的指標(biāo)較少，但為準(zhǔn)確開發(fā)利用五味子藤莖中的五味子素類化合物提供了一定的思路，為細(xì)化開發(fā)利用五味子藤莖中五味子素類化合物提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。