1 基因敲除概述

基因敲除自20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來，是建立在基因同源重組技術(shù)基礎(chǔ)以及胚胎干細(xì)胞技術(shù)基礎(chǔ)上的一種定點(diǎn)修飾基因組的新型分子生物學(xué)技術(shù)，是通過一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)，其與體細(xì)胞核移植技術(shù)的成功結(jié)合，已經(jīng)成為一種有效的定點(diǎn)修飾、改造大動(dòng)物基因組DNA片段的實(shí)驗(yàn)策略?；蛘哒f基因敲除就是通過同源重組將外源基因定點(diǎn)整合入靶細(xì)胞基因組上某一確定的位點(diǎn)，以達(dá)到定點(diǎn)修飾、改造染色體上某一基因的目的的一種技術(shù)。它克服了隨機(jī)整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質(zhì)的方法。20世紀(jì)80年代初，胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)試驗(yàn)的成功奠定了基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。1985年，首次證實(shí)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎(chǔ)。1987年，Thompson首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型。此后的幾年中，基因敲除技術(shù)得到了進(jìn)一步的發(fā)展和完善。

簡單的說，基因敲除是指將目標(biāo)基因從基因組中刪除。比如，有一段“序列”：“1234567890”（原基因），敲除后為“1237890”，一般一個(gè)敲除載體還會(huì)在其中插入一段外源基因，如“ABC”，則新的基因?yàn)椤?23ABC7890”，或者不插入基因直接連接，則為“1237890”。

通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，除了同源重組外，新的原理和技術(shù)也逐漸被應(yīng)用，比較成功的有基因的插入突變和RNAi，它們同樣可以達(dá)到基因敲除的目的。在基因敲除技術(shù)中涉及到的變異類型有基因重組、基因突變、人工誘變。

2 相關(guān)試題評析

2.1 考查基因敲除的基本原理

【例1】 基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，將同源DNA片段導(dǎo)入受體細(xì)胞，使同源DNA片段在原有位置替代了靶基因片段，達(dá)到基因敲除的目的。由此可推測（ ）

A. 基因敲除實(shí)際上是刪除某個(gè)基因，達(dá)到使該基因“沉默”的目的

B. 利用基因敲除技術(shù)不能修復(fù)細(xì)胞中的病變基因

C. 基因敲除可定向改變生物體的某一基因

D. 基因敲除技術(shù)可治療先天性愚型

評析：由題意可知基因敲除實(shí)際上是替換了某個(gè)基因片段，從而達(dá)到使該基因“沉默”的目的，A選項(xiàng)錯(cuò)誤。基因敲除既可以是敲除相應(yīng)的正?；颍部梢郧贸鄳?yīng)的突變基因，可定向改變生物體的某一基因，B選項(xiàng)錯(cuò)誤，選項(xiàng)C正確。先天性愚型是染色體異常引起的遺傳病，多了一條染色體，不能用基因敲除治療，D選項(xiàng)錯(cuò)誤。

參考答案：C。

【例2】 基因敲除是根據(jù)DNA重組原理發(fā)展起來的一門新興技術(shù)。通常用設(shè)計(jì)好的DNA片段替代動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的。運(yùn)用基因敲除技術(shù)構(gòu)建基因敲除動(dòng)物模型是研究基因功能中較為普遍的一種方法，其基本原理如圖1所示。

請回答下列問題：

（1） 在將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞前，需要構(gòu)建一個(gè)基因表達(dá)載體。一個(gè)理想的基因表達(dá)載體，通常由啟動(dòng)子、終止子、目的基因和 等四部分組成。在此過程中，所需使用的相關(guān)工具酶是 。

（2） 如果要獲得一只含目的基因的小鼠，則選擇的受體細(xì)胞通常為 ，基因?qū)朐摷?xì)胞時(shí)，可以采用 等方法。

（3） 上述途徑所獲得的動(dòng)物，其后代并非每一個(gè)個(gè)體都含目的基因，原因是 。

（4） 假設(shè)通過基因敲除構(gòu)建了一個(gè)非球形紅細(xì)胞性貧血（Ⅱ型）模型動(dòng)物，該動(dòng)物因丙酮酸激酶缺陷或葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD）缺陷，使紅細(xì)胞膜變化引起紅細(xì)胞自溶現(xiàn)象，但若向該動(dòng)物注射ATP后，自溶現(xiàn)象可明顯降低。由此可表明，基因?qū)ι镄誀畹目刂品绞街皇牵?。

（5） 某實(shí)驗(yàn)小組向正常小鼠胚胎細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入某“X基因”后，發(fā)現(xiàn)靶基因能正常轉(zhuǎn)錄形成mRNA，但細(xì)胞內(nèi)卻不再合成相應(yīng)蛋白質(zhì)，其原因最可能是

。

評析：通過圖示，可分析出基因敲除的基本原理：應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的。

（1） 基因表達(dá)載體由啟動(dòng)子、終止子、目的基因和標(biāo)記基因四部分組成，在構(gòu)建基因表達(dá)載體過程中，需使用到限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶。

（2） 培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，選擇的受體細(xì)胞通常為受精卵，通過采用顯微注射法將基因表達(dá)載體導(dǎo)入受精卵中。

（3） 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是雜合子，在產(chǎn)生后代時(shí)等位基因分離，所以后代并非每一個(gè)個(gè)體都含有目的基因。

（4） 該動(dòng)物由于酶異常導(dǎo)致紅細(xì)胞自溶，說明基因通過控制酶的合成來控制代謝過程，進(jìn)而控制生物性狀。

（5） 靶基因能正常轉(zhuǎn)錄形成mRNA，但不能合成蛋白質(zhì)。很顯然是翻譯過程不能進(jìn)行，究其原因是“X基因”轉(zhuǎn)錄形成的mRNA與靶基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA雜交，來阻斷蛋白質(zhì)的合成。

參考答案：（1） 標(biāo)記基因 限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）、DNA連接酶 （2） 受精卵 顯微注射法（或病毒感染法） （3） 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為雜合子，在形成生殖細(xì)胞時(shí)等位基因發(fā)生分離 （4） 基因通過控制酶的合成來控制代謝過程，進(jìn)而控制生物性狀 （5） “X基因”轉(zhuǎn)錄形成的mRNA與靶基因控制合成的mRNA雜交，抑制其控制合成酶（蛋白質(zhì)）的過程（或抑制了目的基因的翻譯過程）

2.2 考查CRISPR/Cas9基因定點(diǎn)修飾

【例3】 （2016·江蘇高考） 近年誕生的具有劃時(shí)代意義的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可簡單、準(zhǔn)確地進(jìn)行基因定點(diǎn)編輯。其原理是由一條單鏈向?qū)NA引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶Cas9到一個(gè)特定的基因位點(diǎn)進(jìn)行切割。通過設(shè)計(jì)向?qū)NA中20個(gè)堿基的識別序列，可人為選擇DNA上的目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行切割（圖2）。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（ ）

A. Cas9蛋白由相應(yīng)基因指導(dǎo)在核糖體中合成

B. 向?qū)NA中的雙鏈區(qū)遵循堿基配對原則

C. 向?qū)NA可在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成

D. 若α鏈剪切點(diǎn)附近序列為……TCCACAATC……則相應(yīng)的識別序列為……UCCACAAUC……

評析：此題是對基因編輯技術(shù)的考查，在一個(gè)全新的學(xué)科前沿新情境下，設(shè)置了與核心知識點(diǎn)“蛋白質(zhì)合成”“核酸堿基配對原則”“中心法則”相關(guān)的考點(diǎn)，考查學(xué)生運(yùn)用學(xué)科知識解決問題的能力。解答本題的關(guān)鍵在于結(jié)合圖示理解基因編輯技術(shù)的操作過程，圖中向?qū)NA為雙鏈RNA，與DNA相似，含有氫鍵，兩條鏈間遵循堿基互補(bǔ)配對原則；同時(shí)理解DNA和RNA在堿基上的區(qū)別，前者含T，后者含U，均能與A互補(bǔ)配對，另外理解逆轉(zhuǎn)錄過程也是解答本題的關(guān)鍵，以RNA為模板合成DNA。

提供新情境，以最新的科學(xué)進(jìn)展和實(shí)驗(yàn)素材為背景進(jìn)行命題，學(xué)生在收集信息的同時(shí)，要能與已掌握的相關(guān)知識內(nèi)容相聯(lián)系，準(zhǔn)確處理信息。如上題C選項(xiàng)中提到逆轉(zhuǎn)錄酶，要能迅速想到那是以RNA為模板催化合成DNA的。

參考答案：C。

【例4】 豬的肌肉生長抑制素（MSTN）基因可抑制肌細(xì)胞的增殖和分化。CRISPR/Cas9是一種最新出現(xiàn)的基因編輯技術(shù)，其主要過程是向?qū)NA（gRNA，含與目的基因部分序列配對的單鏈區(qū)）與Cas9核酸酶結(jié)合，引導(dǎo)Cas9核酸酶對DNA局部解旋并進(jìn)行定點(diǎn)切割?？蒲腥藛T利用該技術(shù)定向敲除豬胎兒成纖維細(xì)胞中MSTN基因，以期獲得生長速度快、瘦肉率高的新品種，過程如圖3所示，其中BsmB I、Kpn I、EcoR I表示相應(yīng)限制酶的識別位點(diǎn)。分析回答：

（1） 圖中①過程用到的工具酶有 ，圖中g(shù)RNA基因序列設(shè)計(jì)的主要依據(jù)是 。

（2） 科研人員可利用 （方法）將重組質(zhì)粒導(dǎo)入豬成纖維細(xì)胞，經(jīng) 過程合成Cas9核酸酶。

（3） 過程③與DNA復(fù)制相比，特有的堿基配對方式有 。

（4） 分析發(fā)現(xiàn)某基因敲除細(xì)胞株中MSTN基因的表達(dá)水平為正常細(xì)胞的50%，說明 。

（5） 欲利用MSTN基因缺失成纖維細(xì)胞培育成MSTN基因缺失豬，請簡要說出基本的流程。

。

評析：本題考查基因敲除的相關(guān)知識。要理清CRISPR/Cas9技術(shù)，首先要根據(jù)目的基因上兩端的堿基序列設(shè)計(jì)gRNA基因，接著gRNA基因轉(zhuǎn)錄出gRNA，Cas9基因轉(zhuǎn)錄和翻譯出Cas9核酸酶，Cas9核酸酶與gRNA結(jié)合后，通過gRNA識別目的基因兩端的堿基序列，Cas9核酸酶具有解旋和剪切目的基因的作用，最后DNA自主修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)了基因的定點(diǎn)敲除。

（1） 圖中①過程用到的工具酶有BsmB I和DNA連接酶，圖中g(shù)RNA基因序列設(shè)計(jì)的主要依據(jù)是MSTN基因兩端核苷酸序列，這樣gRNA才能識別MSTN基因兩端核苷酸序列。

（2） 科研人員可利用顯微注射技術(shù)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入豬成纖維細(xì)胞，經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯過程合成Cas9核酸酶。

（3） 過程③為RNA與DNA配對，與DNA復(fù)制相比，特有的堿基配對方式有U-A。

（4） 分析發(fā)現(xiàn)某基因敲除細(xì)胞株中MSTN基因的表達(dá)水平為正常細(xì)胞的50%，說明細(xì)胞中位于一對染色體上的兩個(gè)MSTN基因中僅有一個(gè)被敲除，還有一個(gè)MSTN基因正常表達(dá)。

（5） 欲利用MSTN基因缺失成纖維細(xì)胞培育成MSTN基因缺失豬，可利用MSTN基因缺失成纖維細(xì)胞的核移植到去除核的卵母細(xì)胞中，早期胚胎培養(yǎng)獲得胚胎，再經(jīng)胚胎移植可培養(yǎng)獲得MSTN基因缺失豬。

參考答案：（1） BsmB I和DNA連接酶 MSTN基因兩端核苷酸序列 （2） 顯微注射技術(shù) 轉(zhuǎn)錄和翻譯 （3） U-A （4） 細(xì)胞中位于一對染色體上的兩個(gè)MSTN基因中僅有一個(gè)被敲除 （5） 利用MSTN基因缺失成纖維細(xì)胞的核移植到去除核的卵母細(xì)胞中，早期胚胎培養(yǎng)獲得胚胎，胚胎移植培養(yǎng)獲得MSTN基因缺失豬

2.3 考查基因敲除在基因工程中的應(yīng)用

【例5】 利用“基因敲除”技術(shù)，能“敲除”DNA上的特定基因。該技術(shù)的主要過程如圖4所示。

（1） 胚胎干細(xì)胞可從小白鼠的 中分離得到。

（2） neoR基因插入靶基因使用的工具酶是

和 ，前者識別特定脫氧核苷酸序列并在特定位點(diǎn)切開。“靶基因失活”的含義是

。

（3） 失活靶基因與正常靶基因互換涉及的變異類型是 ；處理后的胚胎干細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到特定培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)。“特定培養(yǎng)基”中需加入 以能起到篩選培養(yǎng)的目的。

（4） 科學(xué)家可以通過“基因敲除”來研究基因的功能，培養(yǎng)圖示中胚胎干細(xì)胞所獲得的“基因敲除”小白鼠 （填“能”或“不能”）直接用于研究基因功能，原因是 。

評析：本題考查基因敲除、基因工程的相關(guān)知識，意在考查考生能理解所學(xué)知識的要點(diǎn)，把握知識間的內(nèi)在聯(lián)系，形成知識網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的能力。同時(shí)要求考生能夠在不同情境下綜合利用所學(xué)知識和技能處理復(fù)雜任務(wù)，具有扎實(shí)的學(xué)科觀念和寬闊的學(xué)科視野，并體現(xiàn)出自身的實(shí)踐能力、創(chuàng)新精神等內(nèi)化的綜合學(xué)科素養(yǎng)。

（1） 胚胎干細(xì)胞可以從早期胚胎或原始性腺中分離得到。

（2） 基因工程用到的工具酶包括限制酶和DNA連接酶；基因是控制生物性狀的基本單位，當(dāng)neoR基因插入靶基因后將導(dǎo)致靶基因的結(jié)構(gòu)被破壞，失去原有的結(jié)構(gòu)和功能，結(jié)果靶基因失活而不能表達(dá)。

（3） 從圖解中可以看出，失活靶基因與正常靶基因是同源互換，故兩者互換片段屬于基因重組；因?yàn)閚eoR基因是新霉素抗性基因，經(jīng)處理后的胚胎干細(xì)胞獲得了neoR基因，所以能在含新霉素的培養(yǎng)基上生存，而未經(jīng)處理的胚胎干細(xì)胞在此培養(yǎng)基上無法生存，故“特定培養(yǎng)基”中需加入新霉素才能起到選擇作用。

（4） 培養(yǎng)圖示中胚胎干細(xì)胞所獲得的“基因敲除”小白鼠不能直接用于研究基因功能，因?yàn)樵撔“资篌w內(nèi)仍有一個(gè)正常的靶基因，也可能表達(dá)性狀。

參考答案：（1） 早期胚胎或原始性腺 （2） 限制性核酸內(nèi)切酶（或限制酶） DNA連接酶 靶基因中的脫氧核苷酸序列發(fā)生改變，不能表達(dá) （3） 基因重組 新霉素 （4） 不能 因?yàn)樵撔“资篌w內(nèi)仍有一個(gè)正常的靶基因，也可能表達(dá)性狀

參考文獻(xiàn)：

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