荊霞??許麗華??陳碧??張維??唐棣??王笑??林志梅??王麗蓮??鄒琳

[摘要] 目的 探討特發(fā)性卵巢早衰與AMH，AMHR-Ⅱ的基因多態(tài)性。 方法 選擇2015年6月～ 2017年3月在我院診斷的特發(fā)性卵巢早衰患者50例為POF組。另選擇健康體檢者100例為對照組。PCR方法測定兩組AMH，AMHR-Ⅱ基因多態(tài)性。 結(jié)果 POF組AMH基因突變位點基因型及等位基因頻率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。POF組AMHR-Ⅱ c.49+10T>G 基因位點GG基因型比例顯著高于對照組，G等位基因頻率顯著高于對照組，c.622-2C>T基因位點TT基因型比例顯著高于對照組，T等位基因頻率顯著高于對照組，c.622-24C>A 基因位點AA基因型比例顯著高于對照組，A等位基因頻率顯著高于對照組，c.1038G>T基因位點TT基因型比例顯著高于對照組，T等位基因頻率顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結(jié)論 AMHR-Ⅱ基因多態(tài)性可能是特發(fā)性卵巢早衰的重要的發(fā)病機制。

[關(guān)鍵詞] 特發(fā)性卵巢早衰；AMH；AMHR-Ⅱ；基因多態(tài)性

[中圖分類號] R711.75 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）12-07-04

Polymorphism analysis of AMH， AMHR- II gene in patients with idiopathic premature ovarian failure

JING Xia XU Lihua CHEN Bi ZHANG Wei TANG Di WANG Xiao LIN Zhimei WANG Lilian ZOU Lin

Reproductive Medicine Centre， Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Guangdong， Zhanjiang 524001， China

[Abstract] Objective To discuss polymorphism analysis of AMH， AMHR-Ⅱ gene in patients with idiopathic premature ovarian failure. Methods 50 cases with idiopathic premature ovarian failure from Jun 2015 to Mar 2017 were selected as POF group. And 100 cases for physical examination were selected as control group. Polymorphismof AMH， AMHR- II gene of two groups was detected by PCR. Results Genotype and allele frequency of AMH gene mutation sites of POF group showed no significant difference with the control group（P>0.05）. The proportion of GG genotype in AMHR- loci II， c.49+10T>G of POF group was higher than that of the control group， and G allele frequency was higher than that of the control group； The proportion ofTTgenotype inc.622-2C>Tof POF group was higher than that of the control group， and Tallele frequency was higher than that of the control group；The proportion ofAAgenotype inc.622-24C>Aof POF group was higher than that of the control group， and Aallele frequency was higher than that of the control group；The proportion ofTTgenotype inc.1038G>Tof POF group was higher than that of the control group， and Tallele frequency was higher than that of the control group； The difference showed significant difference（P<0.05）. Conclusion Polymorphism of AMHR-Ⅱ gene may be an important pathogenesis of idiopathic premature ovarian failure.

[Key words] Idiopathic premature ovarian failure； AMH； AMHR-Ⅱ； Gene polymorphism

特發(fā)性卵巢早衰是指無精確原因的，自身免疫抗體正常的，染色體核型正常的女性在40周歲之前出現(xiàn)的性器官萎縮、持續(xù)性閉經(jīng)，伴有卵泡雌激素、黃體生成素升高，雌激素下降的一種綜合征[1-2]。我國卵巢早衰的發(fā)病率相對較高，而其中有80%為特發(fā)性卵巢早衰，患者主要表現(xiàn)為月經(jīng)紊亂，血管

舒縮功能不穩(wěn)定，容易出汗、潮熱、情緒波動等。目前特發(fā)性卵巢早衰的發(fā)病機制還不十分明確，可能與遺傳、自身免疫因素、感染、代謝異常、環(huán)境等有關(guān)[3-4]。特發(fā)性卵巢早衰尚無明確有效的治療方法?？姑缋占に兀ˋMH）屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員，與人類生殖系統(tǒng)的發(fā)育及功能密切相關(guān)[5-6]。其與抗苗勒激素Ⅱ型受體（AMHR-Ⅱ）結(jié)合而發(fā)揮作用。本研究分析特發(fā)性卵巢早衰患者AMH以及AMHR-Ⅱ基因多態(tài)性，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年6月～2017年3月在我院診斷的特發(fā)性卵巢早衰患者50例為POF組。納入標準：年齡18～39歲，漢族，無月經(jīng)來潮≥4個月；超聲檢查顯示內(nèi)生殖器萎縮；兩次間隔1個月以上檢測空腹血清FSH>40IU/L；排除有明確病因的卵巢早衰。排除標準：既往腮腺炎病史，盆腔結(jié)核病史，卵巢手術(shù)，盆腔內(nèi)放療、化療者。所有患者對本次研究知情同意，本研究經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會同意。另選擇健康體檢者100例為對照組。POF組年齡18 ～ 39歲，平均（35.1±7.5）歲。對照組年齡21～39歲，平均（35.5±7.1）歲。兩組平均年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

1.2 方法

POF組患者與對照組均于月經(jīng)來潮第三天采集晨起空腹靜脈血10mL用于檢測，POF組中無月經(jīng)來潮的患者，B超觀察雙側(cè)卵巢無優(yōu)勢卵泡形成時采集晨起空腹靜脈血標本。-75℃保存待測。血標本提取DNA：采用飽和酚/氯仿法提取目的基因DNA片段；血標本解凍，取2mL置于離心管中，加10mL滅菌蒸餾水，顛倒混勻，靜止10min；4000轉(zhuǎn)/min離心10分鐘，棄上清，重復離心3次，至上清液澄清；沉淀物種加STE700μL，SDS 1～2滴，蛋白裂解酶K 10μL，搖勻，37℃溫浴過夜，至沉淀完全消失，室溫下離心，棄上清，將細胞沉淀轉(zhuǎn)至1.5mL試管；試管內(nèi)加入飽和酚至試管加滿，搖勻，靜置5min，16000轉(zhuǎn)/min離心10分鐘，提取上清液至另一個1.5mL試管，加等體積氯仿，搖勻，靜置5min，16000轉(zhuǎn)/min離心10min，取上清，加入1.5mL試管，加入95%冰凍酒精，醋酸鈉1滴，搖勻；16000轉(zhuǎn)/min離心10min，棄上清，75%冰凍酒精萃洗沉淀，16000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清，自然干燥，得DNA。AMH、AMHR-Ⅱ基因檢測：自數(shù)據(jù)庫中獲得AMH、AMHR-Ⅱ基因相關(guān)序列，采用引物設計軟件設計正向及反向引物。配制引物。PCR反應體系：模板DNA 1μL，正向引物 1μL，反向引物1μL，MgCl2 3μL，10×Buffer 3μL，dNTPs 3μL，Tag酶 0.3μL，H2O 17.7μL。PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。PCR擴增產(chǎn)物進行純化及序列測定。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料以（）表示，采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組AMH基因突變位點基因型及等位基因頻率比較

見表1。POF組AMH基因突變位點基因型及等位基因頻率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.2 兩組AMHR-Ⅱ基因位點基因型及等位基因頻率比較

見表2。POF組AMHR-Ⅱ c.49+10T>G 基因位點GG基因型比例顯著高于對照組，G等位基因頻率顯著高于對照組，c.622-2C>T基因位點

TT基因型比例顯著高于對照組，T等位基因頻率顯著高于對照組，c.622-24C>A 基因位點AA基因型比例顯著高于對照組，A等位基因頻率顯著高于對照組，c.1038G>T基因位點TT基因型比例顯著高于對照組，T等位基因頻率顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3 討論

卵巢早衰是指卵巢功能衰竭所導致的40歲之前即閉經(jīng)的現(xiàn)象。其特點是原發(fā)或繼發(fā)閉經(jīng)伴隨血促性腺激素水平升高和雌激素水平降低，并伴有不同程度的一系列低雌激素癥狀，如潮熱多汗、面部潮紅、性欲低下等。卵巢早衰是一種異質(zhì)性疾病，與自身免疫、遺傳因素、代謝異常、感染、環(huán)境等有關(guān)。卵巢早衰是一種有多種病因的綜合征，在大部分的病例中病因還不明確。患者表現(xiàn)為閉經(jīng)、不孕、低雌激素癥狀、伴發(fā)的自身免疫性疾病等。特發(fā)性卵巢早衰最常見，患者原因不明，患者可無明確的誘因，自身免疫抗體正常，染色體核型正常。特發(fā)性卵巢早衰患者大部分染色體核型分析正常，提示遺傳性治病因素可能發(fā)生在單基因或者核苷酸分子水平。隨著分子生物學計數(shù)的發(fā)展，越來越多的特發(fā)性POF易感基因被發(fā)現(xiàn)[7-8]。

特發(fā)性POF患者表現(xiàn)為先天性卵子數(shù)量減少，正常卵泡閉鎖過程加速，或者出生后卵子被不同機制破壞導致卵泡過早耗竭。卵泡發(fā)生及發(fā)育受下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)控，也與卵泡刺激素有關(guān)，還受到卵巢內(nèi)自分泌、旁分泌的影響。近年來卵巢局部的微調(diào)節(jié)在卵泡生長發(fā)育過程中的作用逐漸受到關(guān)注。卵巢內(nèi)合成局部調(diào)節(jié)因子有轉(zhuǎn)化生長因子超家族、胰島素生長因子系統(tǒng)，顆粒細胞、卵泡膜細胞來源的抑制素、激活素等?？姑缋展芗に兀ˋMH）屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員，與生殖系統(tǒng)發(fā)育及功能有密切的相關(guān)性，在女性生殖功能活動中發(fā)揮重要的作用。AMH異常可導致內(nèi)在卵泡生長發(fā)育異常，卵巢顆粒細胞分泌異常[9-10]。AMH抑制始基卵泡。AMH由兩個相同的70kb亞基通過二硫鍵鏈接組成，屬于二聚糖蛋白，相對分子量140×103，人類AMH編碼基因位于19號染色體短臂。女性AMH主要由卵巢顆粒細胞分泌。AMH抑制始基卵泡的啟動，抑制竇卵泡對FSH的敏感性，抑制卵泡的發(fā)育及成熟[11-12]。AMH是評估卵巢儲備功能的客觀準確的指標，能夠更敏感更準確地反應年齡相關(guān)卵巢儲備功能下降；其不受月經(jīng)周期的影響，具有較強的穩(wěn)定性；AMH不受激素避孕藥的影響，便于臨床使用[13-14]。卵巢的儲備功能取決于卵巢內(nèi)庫存卵泡數(shù)量與質(zhì)量，隨著年齡增長，卵巢內(nèi)存留的可募捐卵泡數(shù)目減少以及卵子質(zhì)量下降可導致生育能力下降，卵巢儲備功能降低[15]。評估卵巢儲備功能對預測生育潛能與卵巢功能狀態(tài)具有重要的臨床意義。在眾多的卵巢儲備功能評估指標中，AMH是最早隨著年齡增長發(fā)生改變的指標，可敏感地評估年齡相關(guān)的生育能力下降。AMH受體分為Ⅰ型與Ⅱ型兩種，表達在苗勒氏管周圍間質(zhì)細胞、兩性性腺。研究證實AMHR-Ⅱ型與AMH具有高度的親和力，AMH與其結(jié)合后，發(fā)揮相應的作用。

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。本研究中分析POF患者與健康對照組AMH以及AMHR-Ⅱ單核苷酸多態(tài)性，分析與POF的相關(guān)性。分析結(jié)果顯示，POF患者與健康對照組AMH單核苷酸多態(tài)性在c.146T>G、c.303G>A、c.546G>A基因型及等位基因頻率并沒有顯著地差異。而AMHR-Ⅱ單核苷酸多態(tài)性在c.49+10T>G 、c.622-2C>T、c.622-24C>A、c.1038G>T 基因型及等位基因頻率存在顯著差異。這個結(jié)果提示，在POF的發(fā)病機制中，AMH基因多態(tài)性可能并未參與，而AMHR-Ⅱ基因多態(tài)性與POF的發(fā)病具有密切的關(guān)系，可能是直接或者間接導致特發(fā)性POF的相關(guān)位點。

綜上所述， AMHR-Ⅱ基因多態(tài)性可能是特發(fā)性卵巢早衰的重要的發(fā)病機制之一。

[參考文獻]

[1] Reato G， Morlin L， Chen S， et al. Premature ovarian failure in pa-tients with autoimmune Addisons disease：clinical，genetic，and im-munological evaluation[J].Journal of Clinical Endocrinology & Me-tabolism，2011，96（8）：1255-1261.

[2] 張秀，魯雅，王佩娟.卵巢早衰的病因研究進展[J].湖北中醫(yī)藥大學學報，2017，19（1）：118-120.

[3] 祝雨田，張副興，丁彩飛.微小RNA在卵巢早衰中的研究概況及應用前景[J].中國性科學，2016，25（2）：20-22.

[4] 王華杭，王雪莉，呼軍明，等. 激素替代聯(lián)合中藥治療卵巢早衰46例療效觀察[J].河南醫(yī)學研究，2014，23（9）：30-32.

[5] 伍嘉雯.抗苗勒氏管激素與多囊卵巢綜合征的相關(guān)性分析[J].中國藥物經(jīng)濟學，2016，11（12）：100-102.

[6] 韓巍巍，Schaffrath M，Holze V，等.抗苗勒激素對ICSI治療中卵巢反應的預測價值[J].同濟大學學報：醫(yī)學 版，2011，32（1）：40-45.

[7] 文艷飛，蔡柳洪，何文，等.卵巢早衰患者來源的誘導多能干細胞的建系、鑒定及誘導分化[J].中國病理生理雜志，2016，32（1）：140-145.

[8] 覃春容，姚吉龍，任曉慧，等.卵巢早衰212例臨床研究[J].中國婦幼保健，2016，31（2）：244-245.

[9] 秦辛玲，葉元，石青峰，等.血清抗苗勒管激素預測卵巢早衰的臨床價值[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，19（25）：3240-3241.

[10] 吳庚香，劉倩，楊菁.抗苗勒管激素測定在疾病診斷中的應用[J].實用婦產(chǎn)科雜志，2015，31（8）：565-567.

[11] 陳曉，季銀芬，徐鍵.抗苗勒氏管激素（AMH）與多囊卵巢綜合征（PCOS）卵泡發(fā)育異常的關(guān)系[J].生殖與避孕，2014，34（5）：383-387

[12] 趙曄.女性體內(nèi)抗苗勒氏管激素（AMH）的生理作用及臨床應用進展[J].中外醫(yī)療，2014，33（29）：195-196.

[13] 徐燕穎，，尹利榮，陳逢振，等.多囊卵巢綜合征患者抗苗勒氏管激素與相關(guān)臨床指標的關(guān)系[J].天津醫(yī)藥，2013，41（2）：119-121.

[14] 程麗平，郭躍貞，夏麗，等.多囊卵巢綜合征與抗苗勒氏管激素的相關(guān)分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2008，16（2）：103-104.

[15] 任紅，王海旭，趙海波，等.達英-35對PCOS患者血清AMH水平的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，21（8）：832-833.

（收稿日期：2017-05-09）