蔣義，張鋼，郭咚，張會(huì)平

(湖南省血液中心檢驗(yàn)科，長(zhǎng)沙 410000)

·質(zhì)量管理研究·

血液病毒核酸篩查系統(tǒng)室內(nèi)質(zhì)控方法的建立及評(píng)價(jià)

蔣義，張鋼，郭咚，張會(huì)平

(湖南省血液中心檢驗(yàn)科，長(zhǎng)沙 410000)

室內(nèi)質(zhì)控；病毒核酸；血液篩查

目前全國(guó)采供血機(jī)構(gòu)核酸檢測(cè)(nucleic acid test，NAT)技術(shù)已經(jīng)全面普及，其涉及到許多環(huán)節(jié)，而室內(nèi)質(zhì)量控制對(duì)于保證NAT結(jié)果的可靠性具有重要意義。然而各血站實(shí)驗(yàn)室尚未建立較統(tǒng)一的NAT質(zhì)量控制體系。由于各實(shí)驗(yàn)室使用的檢測(cè)系統(tǒng)、人員操作及結(jié)果判斷等不同，導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果差異較大，可比性較差。建立本實(shí)驗(yàn)室可行的核酸標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量控制方法是實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的有力保障?！堆竞怂釞z測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證指南》中提到血站核酸檢測(cè)室內(nèi)質(zhì)控的基本要求：每一批檢測(cè)應(yīng)至少有一個(gè)弱陽(yáng)性室內(nèi)質(zhì)控品，基于PCR原理的檢測(cè)方法可以用循環(huán)閾值(Ct值)作為檢測(cè)值做質(zhì)控圖[1]。本實(shí)驗(yàn)室結(jié)合檢測(cè)系統(tǒng)的混樣方式及檢測(cè)下限，設(shè)計(jì)出陽(yáng)性室內(nèi)質(zhì)控品與陰性質(zhì)控品檢測(cè)方案，評(píng)價(jià)該室內(nèi)質(zhì)控模式的可行性，監(jiān)控室內(nèi)質(zhì)控體系的運(yùn)行情況。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 質(zhì)控品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用北京康切斯特HBV/HCV/HIV(批號(hào)：201601001)，每支1.5 mL，濃度分別為200 IU/mL、2 000 IU/mL及2 000 IU/mL；NAT陰性質(zhì)控品采用國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評(píng)結(jié)果陰性的質(zhì)控品，-20 ℃保存?zhèn)溆谩BV、HCV、HIV(1型)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光法，批號(hào)：20160514，含提取、擴(kuò)增試劑以及陰、陽(yáng)性對(duì)照，上海科華公司)；全自動(dòng)核酸提取儀STAR(HAMILTON公司)；ABI 7500熒光PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.2 質(zhì)控品檢測(cè) 按照科華公司試劑說(shuō)明書的操作步驟，質(zhì)控品與獻(xiàn)血員血液標(biāo)本在同樣條件下進(jìn)行8混樣匯集檢測(cè)。在匯于1個(gè)匯集管的特定位置分別放入HBV DNA、HCV RNA及HIV RNA質(zhì)控品與5份已知陰性標(biāo)本，另在匯入1個(gè)匯集管的特定位置放入1個(gè)陰性質(zhì)控及7個(gè)未知檢測(cè)結(jié)果的獻(xiàn)血者標(biāo)本，同時(shí)每批實(shí)驗(yàn)含1個(gè)陰性對(duì)照和1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照。陰性質(zhì)控及陰、陽(yáng)性對(duì)照物結(jié)果均應(yīng)符合實(shí)驗(yàn)要求，該批次實(shí)驗(yàn)結(jié)果才有效。

1.3 Ct值與質(zhì)控品濃度的相關(guān)性分析 以HBV DNA為例，將已知濃度的HBV DNA質(zhì)控品用陰性血清倍比稀釋，對(duì)每一濃度梯度的血清進(jìn)行檢測(cè)(方法同1.2)，所得Ct值與各濃度作相關(guān)性分析[2]。

1.5 室內(nèi)質(zhì)量控制結(jié)果分析 得出質(zhì)控品的最適合濃度，在同一批號(hào)下再檢測(cè)180次，檢測(cè)方法同1.2。分析并評(píng)價(jià)該室內(nèi)質(zhì)控模式的可行性。

1.6 實(shí)驗(yàn)有效性判斷 結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法，判斷每批實(shí)驗(yàn)的有效性。此外，將陰性質(zhì)控和7份獻(xiàn)血者標(biāo)本一起檢測(cè)時(shí)，如結(jié)果為陰性，實(shí)驗(yàn)有效；如為陽(yáng)性，第2天繼續(xù)將此孔所含的陰性質(zhì)控及7份樣本單獨(dú)檢測(cè)，若陰性質(zhì)控為陰性，則實(shí)驗(yàn)有效。陰、陽(yáng)性對(duì)照物結(jié)果均符合實(shí)驗(yàn)要求，該批次實(shí)驗(yàn)有效。只有滿足以上所有條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才有效與可信。

2 結(jié)果

2.1 HBV DNA室內(nèi)質(zhì)控品濃度與Ct值檢測(cè)關(guān)系 質(zhì)控品倍比稀釋后Ct值數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。室內(nèi)質(zhì)控品濃度與Ct值的相關(guān)系數(shù)r=-0.920，在0.05水平達(dá)到高度相關(guān)。

表1 HBV DNA室內(nèi)質(zhì)控品濃度與Ct值檢測(cè)結(jié)果

圖1 Levey-Jennings質(zhì)控框架圖

圖2 180次質(zhì)控品的質(zhì)控圖

2.4 室間質(zhì)評(píng)結(jié)果 在進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控期間，本實(shí)驗(yàn)室參加了澳大利亞NRL國(guó)家室間質(zhì)評(píng)(委托上海血液中心提供)及國(guó)家衛(wèi)計(jì)委核酸實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)，在陽(yáng)性室內(nèi)質(zhì)控Ct值在控、陰性質(zhì)控及陰、陽(yáng)性對(duì)照有效的情況下，室間質(zhì)控結(jié)果與靶值完全一致。

3 討論

Ct值指在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，熒光信號(hào)由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的閾值所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。核酸檢測(cè)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)與病毒載量存在一定的線性關(guān)系，在指數(shù)擴(kuò)增的開(kāi)始階段進(jìn)行檢測(cè)，此時(shí)樣品間的誤差尚未放大，因此該Ct值具有很好的重復(fù)性[4]。由表1可知，質(zhì)控品濃度與Ct值呈高度相關(guān)。

質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果是核酸提取和檢測(cè)有效性的綜合反映?？迫A核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書提供的8人份混檢獻(xiàn)血員血漿的HBV DNA 95%置信區(qū)間的檢出限為50 IU/mL。本實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買的HBV DNA室內(nèi)質(zhì)控品的濃度為200 IU/mL。在前期實(shí)驗(yàn)時(shí)此濃度陽(yáng)性質(zhì)控品全部檢出陽(yáng)性，濃度過(guò)高，質(zhì)控品則失去其應(yīng)有的監(jiān)控意義。有相當(dāng)一部分HBV“窗口期”和隱匿性感染者中的病毒載量甚至低于10 IU/mL，室內(nèi)質(zhì)控濃度越接近最低檢測(cè)限，反映測(cè)定操作變異的靈敏度越高，故我們認(rèn)為室內(nèi)質(zhì)控濃度應(yīng)盡可能接近試劑與系統(tǒng)最低檢測(cè)限，但實(shí)際工作發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)用低檢測(cè)限濃度的質(zhì)控品檢測(cè)的穩(wěn)定性較差[5]。最終我們實(shí)驗(yàn)探索出濃度為100 IU/mL的HBV DNA室內(nèi)質(zhì)控品，連續(xù)測(cè)定20次后計(jì)算出Ct值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，繪制出Levey-Jennings質(zhì)控圖。

由結(jié)果可知Ct值質(zhì)量控制有很好的重復(fù)性、穩(wěn)定性。據(jù)有關(guān)報(bào)道，自行配制的室內(nèi)質(zhì)控品隨保存時(shí)間延長(zhǎng)，其病毒載量降低，建議室內(nèi)質(zhì)控品解凍后最好在72 h內(nèi)使用[6]，我們實(shí)驗(yàn)室自行配制的質(zhì)控品能在48 h內(nèi)用完，因此能保證質(zhì)控品的穩(wěn)定性。以此框架下進(jìn)行的衛(wèi)生部室間質(zhì)評(píng)，結(jié)果與靶值完全一致，證明用該濃度下Ct值建立核酸檢測(cè)室內(nèi)質(zhì)量控制模式完全可行與可靠。

本實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控其有效CV為3.53%，批間差異較小，測(cè)定結(jié)果較穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中若更換試劑批號(hào),則重新用即刻法計(jì)算得出20次的Ct值和CV。此次分析過(guò)程中，未出現(xiàn)試劑及質(zhì)控品批號(hào)更換。在此后又進(jìn)行180次檢測(cè)，有1次未檢出陽(yáng)性，檢出符合率為99.5%。未檢出可能原因?yàn)椋?1)核酸提取過(guò)程中的隨機(jī)誤差，如核酸提取中的靶核酸丟失、有機(jī)溶劑的去除不徹底、標(biāo)本中擴(kuò)增抑制物的殘留，耗材有PCR抑制物等;(2)儀器的問(wèn)題,如擴(kuò)增儀孔間溫度的不均一;(3)試劑問(wèn)題,如反轉(zhuǎn)錄酶的失活[1]；(4)人員操作問(wèn)題,如磁珠未混勻。結(jié)果表明，室內(nèi)質(zhì)控品的Ct值有2次超過(guò)了2s，根據(jù)Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法，當(dāng)室內(nèi)質(zhì)控品測(cè)定值超出12S告警規(guī)則時(shí)，可啟動(dòng)其他規(guī)則如R4S、22S、41S、10X判斷其是否有效[7]。

陰性質(zhì)控樣本失控的原因主要為擴(kuò)增產(chǎn)物的污染或者是核酸提取過(guò)程中發(fā)生的標(biāo)本間交叉污染。在此過(guò)程中本實(shí)驗(yàn)室未出現(xiàn)陰性質(zhì)控?zé)o效情況。

本實(shí)驗(yàn)室選擇的弱陽(yáng)性質(zhì)控品能增強(qiáng)當(dāng)次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，可以排除因人員更換等實(shí)驗(yàn)條件的差異而導(dǎo)致的誤差，可用于日常監(jiān)控核酸提取擴(kuò)增檢測(cè)的有效性。

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(本文編輯：劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.17

蔣義，1987年生，女，主管技師，碩士研究生，主要從事核酸檢測(cè)工作。

張鋼，主任技師，大學(xué)本科，E-mail:781451761@qq.com。

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2017-05-16)