劉燦，歐啟水

(福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，福州 350005)

·綜述·

HBV基因突變及其臨床意義研究進展

劉燦，歐啟水

(福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，福州 350005)

HBV以準種形式存在患者體內，不同基因區(qū)的準種變化具有明顯的異質性，其對疾病的診斷、治療及轉歸均有一定影響。理解HBV突變及其改變的分子及病理特征，有助于實現(xiàn)不同乙肝感染患者的分層管理，促進更精準的個體化治療。該文就HBV基因突變及其臨床意義研究進展作一綜述。

HBV；基因；突變；臨床意義

HBV為部分雙鏈環(huán)狀嗜肝DNA病毒，基因組含4個部分重疊的開放讀碼框(open reading frame，ORF)，即前-S/S區(qū)、前-C/C區(qū)、P區(qū)和X區(qū)。HBV侵入機體后脫衣殼形成松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)，進入靶細胞核內，在DNA聚合酶作用下合成共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)，再經過RNA聚合酶轉錄成各種大小不同的mRNA，其中前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)在HBV逆轉錄酶作用下合成完整的HBV DNA，其他mRNA則翻譯成病毒的各種蛋白質成份(見圖1)[1]。根據HBV基因組序列差異性>8%和S基因序列差異性>4%，可將HBV區(qū)分為至少10個基因型(A～J型)及若干個基因亞型，我國主要以B、C基因型感染為主[2]。然而，由于HBV逆轉錄過程缺乏嚴格的校正機制，每104～105核苷酸就會出現(xiàn)1個突變。因此，每一個患者體內的病毒構成并不均一，而是由HBV基因序列存在微小差異的多種病毒株組成，并始終處于動態(tài)變化過程中，即以準種(quasispecies)形式存在[3]。HBV準種的異質性變化包括復雜性和多樣性改變[4]，不同基因型HBV的準種異質性變化對疾病的診斷、治療及轉歸均有一定的影響。本文就HBV不同基因區(qū)的突變、抗病毒療效及臨床轉歸的關系等作一綜述。

注：本圖在文獻[1]基礎上修改而成；NTCP，鈉離子/?；悄懰峁厕D運多肽；rcDNA，松弛環(huán)狀DNA；cccDNA，共價閉合環(huán)狀DNA；pgRNA，前基因組RNA。

圖1 HBV感染流程

1 前-S/S區(qū)基因突變及其臨床意義

HBV前-S/S區(qū)基因包括preS1區(qū)、preS2區(qū)和S區(qū)，分別有各自的起始密碼子，但共用一個終止密碼子[5](見圖2A)。前-S/S區(qū)基因主要編碼3種包膜蛋白：大蛋白、中蛋白和主蛋白，分別又稱L、M和S蛋白。preS1因基因亞型的不同而造成編碼氨基酸長度不固定，由108至126個氨基酸構成，此區(qū)域包含與肝細胞結合受體鈉離子/?；悄懰峁厕D運多肽(Na+/taurocholate cotransporting polypeptide， NTCP)的結構域，在病毒感染進入細胞中起重要作用[6]。preS2由55個氨基酸組成，與T、B淋巴細胞免疫表位識別有關[7]。S區(qū)基因由226個氨基酸組成，包括N端區(qū)(aa1～98)、主要親水區(qū)(major hydrophilic region，MHR，aa99～169)和C端區(qū)(aa170～226)，負責編碼HBsAg，是病毒包膜蛋白的主要抗原區(qū)域[7]。

前-S序列是整個HBV基因組中異質性最高的區(qū)域，突變類型包括替換、缺失和插入等多種形式，見表1。相對于B基因型，preS1/preS2區(qū)突變更常發(fā)生于HBV C型感染患者[5]。S區(qū)基因突變主要集中在MHR，發(fā)生在“a”決定區(qū)(aa124～147，能誘導機體針對所有HBV亞型產生保護性應答的區(qū)域)的突變，可改變HBsAg的空間構象引起抗原性質改變，無法被抗HBs抗體中和，成為免疫逃逸突變；發(fā)生在“a”決定區(qū)以外的突變，除了發(fā)生免疫逃逸外，還常常影響肝臟疾病進展及核苷(酸)類似物(NAs)耐藥的發(fā)生，見表1。前-S/S區(qū)基因突變也會對臨床HBsAg檢測造成影響[8]。如產生的HBsAg無法被商品化試劑檢出，容易出現(xiàn)HBsAg/抗HBs抗體雙陽性的結果，甚至造成隱匿性肝炎(occult hepatitis B virus infection，OBI)的發(fā)生[9]。另一方面，不同的檢測系統(tǒng)對突變株的檢測能力不一[10]。Servant-Delmas等[11]比較了13種商品化試劑檢測HBsAg的結果，發(fā)現(xiàn)對不同類型突變株不同試劑檢測結果間存在差異，其總體檢出率從62.9%～97.9%不等。因此，當臨床對HBsAg檢測結果持有疑議時，應盡可能采用另一種方法進行復檢。

S區(qū)基因與HBV逆轉錄酶區(qū)基因重疊，有研究利用二代測序平臺(next generation sequencing，NGS)如超深焦磷酸測序(ultra-deep pyrosequencing, UDPS)等在NAs治療患者中發(fā)現(xiàn)了一些新的低比例(0.13%～0.17%)突變位點，如sW156stop、sW163stop、sW165stop和sW191stop等[12-13]，會導致HBsAg合成缺陷。然而，這些低比例突變的確定臨床意義目前尚不明了。

注：A，前-S/S區(qū)基因結構； B，前-C/C區(qū)基因結構及編碼產物； C，HBV P區(qū)基因結構；D，HBV X區(qū)基因結構；nt，核苷酸；rt，逆轉錄酶；aa，氨基酸；MHR區(qū)，主要親水區(qū)；NRD負向調控原件。

圖2 HBV各基因區(qū)結構

注：*，終止密碼；突變堿基前未加“nt”均代表氨基酸位點(全文同)。

2 前-C/C區(qū)基因突變及其臨床影響

HBV前-C/C區(qū)基因依據各自的起始密碼子，在基本核心啟動子(basal core promoter，BCP)引導下，轉錄成preC mRNA和pgRNA，前者翻譯成前核心蛋白和核心蛋白，進而剪切成HBeAg和HBcAg[5](圖2B)。文獻報道HBV前-C/C區(qū)基因的異質性常發(fā)生在BCP和前-C區(qū)，見表2。BCP和前-C區(qū)突變會促進HBeAg血清學轉換，因此早期檢出BCP和前-C區(qū)突變可以預測HBeAg的血清學轉換[24]。與HBeAg陽性患者相比，HBeAg陰性患者更易發(fā)生前-C區(qū)突變，而且這些突變并不引起DNA拷貝數的變化，但與肝臟疾病進展密切相關[25]。有研究顯示，BCP/前-C區(qū)突變可能對抗病毒藥物具有更高的敏感性[26-27]，但如果BCP/前-C突變聯(lián)合前-S1/S2缺失，往往會導致更嚴重的肝臟疾病如暴發(fā)性肝炎和HCC的發(fā)生[28]。而且，BCP/前-C區(qū)突變與基因型相關，好發(fā)于HBV基因型B和D感染的患者[29]。

表2 常見BCP、前-C/C區(qū)突變及臨床影響

最近有研究利用高靈敏UDPS技術，分析BCP、前-C/C區(qū)基因的異質性，發(fā)現(xiàn)在基線水平即存有少量G1896A、G1899A和前-C區(qū)起始密碼子突變，并隨疾病進展不斷變化[26]；Bayliss等[32]利用NGS檢測HBeAg陽性患者發(fā)現(xiàn)，基線水平存在少量可檢測的BCP/前-C突變，會顯著降低NAs治療后HBsAg的清除率。

3 P區(qū)基因突變及其臨床意義

P區(qū)是最長的HBV基因區(qū)，包含4個功能結構域：末端蛋白(terminal protain，TP)、間隔區(qū)(spacer region, Spc)、逆轉錄酶(RT)區(qū)和RNA酶H區(qū)(RNH)，其中RT區(qū)又可分為7個結構域(圖2C)。P區(qū)編碼DNA聚合酶，參與HBV DNA的合成及pgRNA的逆轉錄。TP位于P區(qū)N端，作為DNA負鏈合成的初始引物；Spc區(qū)作為聚合酶功能非必要的補充，更能耐受突變，由于間隔區(qū)與前-S區(qū)部分交叉，因此該區(qū)域變異亦會引起相應的HBsAg氨基酸位點的改變；RT區(qū)具備DNA聚合酶活性和逆轉錄活性，其催化中心位于nt736～747(即YMDD區(qū))，該區(qū)在所有基因型中高度保守，在HBV復制中發(fā)揮著重要作用；RNA酶H區(qū)位于P區(qū)C端，參與RNA的衣殼包裝和負鏈DNA的合成[34]。

抗病毒治療藥物NAs主要通過競爭結合HBV DNA聚合酶尤其是RT區(qū)，發(fā)揮強效抑制病毒復制的作用，一旦該區(qū)基因發(fā)生變異，就會導致NAs結合力下降，從而失去對突變株的抑制能力，產生耐藥[35]。因此，以往研究最多的HBV P區(qū)異質性主要集中在RT區(qū)，見表3。與干擾素治療相比，A、B基因型較C、D基因型具有更好的應答效果，然而基因型差異對NAs的療效應答情況目前仍知之甚少[2]。

表3 常見RT區(qū)突變及臨床影響

注：LMV，拉米夫定；ADF，阿德福韋酯；ETV，恩替卡韋；TDF，富馬酸替諾福韋酯；LdT,替比夫定；ETV耐藥相關變異是在rtM204V/I+rtLl80M變異基礎上，再聯(lián)合其他至少一個位點的氨基酸替代變異；*，僅在體外實驗發(fā)現(xiàn)，在臨床實踐中并未完全確認TDF的耐藥位點。

本課題組曾構建高靈敏RT-AS-LNA-qPCR[44]和RT-ARMS-qPCR[45]技術，分別用于HBV YIDD(rtM204I)和YVDD(rtM204V)突變株的定量檢測，初步揭示了早期檢出低比例突變DNA對NAs的療效預測價值。近來有研究利用NGS平臺顯示，NAs治療的CHB患者其HBV RT區(qū)準種異質性呈現(xiàn)多樣性及低比例變化的趨勢[5,46-48]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，選擇LAM或LdT治療4周時，應答組RT區(qū)準種復雜性和多樣性顯著低于無應答組[46]，采用ETV時，完全應答組較部分應答組準種復雜性降低，而準種多樣性增加[5,48]，提示不同準種異質性對藥物的動力學和藥效學變化有影響；而且高基線水平RT 2區(qū)(與S區(qū)基因重疊的B、C結構域)的準種異質性可預測病毒學應答[47]。盡管如此，這些在基線水平及NAs治療過程中出現(xiàn)的低比例耐藥突變，其確切的臨床意義仍未完全闡明。

4 X區(qū)基因突變及其臨床意義

X區(qū)是HBV最小的基因區(qū)，N端含負向調控域(negative regulatory domain，NRD)，具有抗凋亡基因；C端為轉錄因子結合區(qū)(transcription factor binding)，含促凋亡基因[49]。其編碼產物HBx蛋白不與宿主及病毒DNA直接結合，主要通過激活或抑制轉錄因子對HBV DNA病毒轉錄、復制及宿主細胞基因起調控作用，是導致肝癌發(fā)生的關鍵分子[50]。X區(qū)基因突變主要發(fā)生在肝癌患者，有研究顯示，當存在K130M+V131I雙聯(lián)突變及V5M/L+K130M+V131I三聯(lián)突變時，HCC的風險分別提高3.75倍和5.34倍[51]。鑒于X區(qū)基因突變與HCC密切相關，有研究利用測序技術，發(fā)現(xiàn)當8個X區(qū)基因位點(包括ntG1613A，ntC1653T，ntT1753V，ntA1762T，ntG1764A，ntA1846T，ntG1896A和ntG1899A)出現(xiàn)≥6個突變位點陽性作為預測HCC的指標，其敏感性為44.0%，特異性可達99.7%[52]。

目前，單獨針對X區(qū)基因的二代測序研究較少。研究顯示與前-C區(qū)重疊的X區(qū)基因(nt 1 814～1 838)中，當存有少量(0.16%)ntT1836C突變時，會導致原有的終止密碼子TAA突變?yōu)榫幋a谷氨酰胺的密碼子CAA，從而產生的HBx蛋白的羧基末端比正常HBx多51個氨基酸，致使HBx蛋白發(fā)生潛在的功能性改變[26]。

5 小結與展望

HBV基因組具有明顯的準種異質性，有些與病毒治療反應有關，有些與免疫逃逸相關，有些可加速肝臟疾病進展，有些會引起檢測結果不一致。因此，借助于分子診斷技術的發(fā)展及臨床研究的深入，能進一步了解不同HBV基因突變的臨床意義，尤其是證實一些低比例突變的時空特性，更好地針對不同的乙肝感染個體做出精準醫(yī)療決策。

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(本文編輯：周萬青，劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.11

國家自然科學基金(81572067，81672101)；福建省自然科學基金(2015J01385)。

劉燦，1979 年生，男，博士研究生，主要事乙型肝炎病毒診斷與療效監(jiān)測研究。

歐啟水，主任技師，教授，博士研究生導師，E-mail：ouqishui@163.com。

R446.6

A

2016-12-20)