胡詠梅，鄒明祥，李軍，豆清婭，王海晨，晏群，劉文恩

(中南大學湘雅醫(yī)院a.檢驗科，b.醫(yī)院感染控制中心，長沙 410008)

·臨床實驗研究·

同一患者不同部位分離耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥機制研究及同源性分析

胡詠梅a，鄒明祥a，李軍a，豆清婭b，王海晨a，晏群a，劉文恩a

(中南大學湘雅醫(yī)院a.檢驗科，b.醫(yī)院感染控制中心，長沙 410008)

目的 對臨床分離自同一患者不同部位的3株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌進行耐藥機制研究及同源性分析。方法 對某嚴重燒傷患者的股靜脈導管尖端、創(chuàng)面分泌物及痰液標本中分離到的3株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌，采用改良Hodge試驗檢測碳青霉烯酶，雙紙片協(xié)同及增效試驗檢測金屬β-內酰胺酶；PCR篩查耐藥基因；腸桿菌科基因間重復序列-聚合酶鏈反應(ERIC-PCR)進行同源性分析，多位點序列分型技術(MLST)對肺炎克雷伯菌進行分子生物學分型。結果 3株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的改良Hodge試驗均為陰性，雙紙片協(xié)同及增效試驗均為陽性；3株菌均檢出blaNDM-1基因，而未檢出blaKPC、blaGES、blaIMP、blaSPM、blaVIM、blaGIM及blaOXA-48等耐藥基因；ERIC-PCR顯示3株菌為同一型別，MLST分型結果顯示3株菌均屬于ST17型。結論 3株肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機制為攜帶blaNDM-1基因，且這3株菌為同一克隆。

多部位感染；肺炎克雷伯菌；新德里金屬β-內酰胺酶Ⅰ型；多位點序列分型

近年來，碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌不斷出現(xiàn)，尤其是耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌在全球出現(xiàn)并廣泛流行，使臨床抗感染治療面臨極大的挑戰(zhàn)。本研究收集2014年從1例嚴重燒傷患者的股靜脈導管尖端、創(chuàng)面分泌物及痰液3種標本中分離到的3株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌，對其耐藥機制和同源性進行分析，以期為臨床抗感染治療以及預防其傳播提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2014年從我院燒傷科1例嚴重燒傷患者的股靜脈導管尖端、創(chuàng)面分泌物及痰液3種標本中分離到3株對亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌，檢出時間分別為3月8日、3月17日及4月1日，按照時間序列分別標記為KP1、KP2和 KP3。質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922及肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705/1706。

1.2 主要試劑與儀器 藥敏紙片(英國Oxoid公司)，亞胺培南、美羅培南及氨曲南的E-test試劑條

(鄭州安圖生物公司)，引物及5×TBE電泳緩沖液(上海生工公司)，DNA marker D2000(大連寶生物公司)，2×Taq PCR Master Mix試劑(北京百泰克公司)；Vitek 2 Compact(法國生物梅里埃公司)，ABI 2720 PCR擴增儀(美國ABI公司)，高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，Hoefer PS2A200水平電泳儀(美國Hoefer公司)，InGenius凝膠成像分析系統(tǒng)(英國Syngene公司)。

1.3 藥敏試驗 用K-B法測定10種抗菌藥物的抑菌圈直徑；E-test法測定亞胺培南、美羅培南和氨曲南的最小抑菌濃度(MIC)，結果根據(jù)美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)2016版標準進行判斷。

1.4 改良Hodge試驗篩查碳青霉烯酶 按照CLSI 2016版操作規(guī)程進行試驗。若待測菌劃線與抑菌圈邊緣交叉處有矢狀生長則為陽性。分別以肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705/1706作為陽性和陰性質控菌株。

1.5 雙紙片協(xié)同試驗及雙紙片增效試驗檢測金屬β-內酰胺酶 將0.5麥氏濁度單位的待測菌菌液涂布于M-H平板，分別粘貼EDTA紙片(0.5 mol/L EDTA 5 μL)、亞胺培南紙片(10 μg)和亞胺培南紙片(10 μg)+EDTA(0.5 mol/L EDTA 5 μL)組合紙片，35 ℃過夜培養(yǎng)[1]。若亞胺培南抑菌圈在靠近EDTA側出現(xiàn)匙孔或抑菌圈明顯擴大(雙紙片協(xié)同試驗)或組合紙片與亞胺培南紙片的抑菌圈直徑相差≥6 mm(雙紙片增效試驗)則為陽性。

1.6 耐藥基因篩查 根據(jù)文獻[1-3]設計引物，引物序列見表1。PCR反應體系為25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，無菌雙蒸水8.5 μL。 PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度(見表1)30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；最后再72 ℃延伸5 min。擴增產物送上海鉑尚公司測序，序列經BLAST數(shù)據(jù)庫進行比對分析。

表1 碳青霉烯酶基因檢測所用引物

1.7 ERIC-PCR DNA指紋圖譜分析 根據(jù)文獻[4]設計引物，ERIC-2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGT

GAGCG-3′。PCR反應體系為25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、10 μmol/L引物1 μL、DNA模板2 μL、無菌雙蒸水9.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸3 min。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)進行觀察及拍照分析。凡條帶數(shù)目和位置完全相同者，則判為同一克隆型。

1.8 多位點序列分型(multilocus sequence typing, MLST) 選取7個管家基因(gapA、mdh、pgi、phoE、infB、rpoB、tonB)構建肺炎克雷伯菌的MLST研究方案，管家基因的引物序列及PCR反應條件參照http://bigsdb.web.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.html，PCR反應體系見1.6。擴增產物送上海鉑尚公司測序，將測序后結果與MLST數(shù)據(jù)庫(http://bigsdb.web.pasteur.fr/)進行比對得出序列型別。

2 結果

2.1 藥敏試驗結果 結果顯示，3株細菌對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和復方磺胺甲噁唑均耐藥，但是其中KP1菌株對慶大霉素、妥布霉素及阿米卡星敏感，而KP2和KP3對慶大霉素和妥布霉素耐藥，僅對阿米卡星敏感；3株菌對亞胺培南、美羅培南及氨曲南均耐藥。

2.2 碳青霉烯酶篩查及金屬酶表型結果 3株肺炎克雷伯菌經改良Hodge試驗檢測碳青霉烯酶，結果均為陰性；雙紙片協(xié)同及增效試驗檢測金屬β-內酰胺酶，結果均為陽性。

2.3 耐藥基因檢測 3株細菌均攜帶blaNDM-1基因，未檢出blaKPC、blaGES、blaIMP、blaSPM、blaVIM、blaGIM及blaOXA-487種耐藥基因。見圖1。

注：M，DNA marker；KP1～KP3，待測菌株。

圖1 3株肺炎克雷伯菌blaNDM-1基因的PCR電泳

2.4 ERIC-PCR指紋圖譜 ERIC-PCR結果顯示，KP1、KP2和KP3具有完全相同的DNA指紋圖譜，屬于同一克隆型。見圖2。

2.5 多位點序列分析結果 通過對7個管家基因進行PCR擴增及測序，將測序結果與MLST數(shù)據(jù)庫內已有的標準序列進行比對，結果顯示：3株肺炎克雷伯菌均為ST17型。

注：M，DNA marker；KP1～KP3，待測菌株。

圖2 3株肺炎克雷伯菌的ERIC-PCR指紋圖譜

3 討論

細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥是多種機制共同參與的結果，其中最主要的原因是產碳青霉烯酶。本研究對某患者不同部位分離的3株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌進行8種碳青霉烯酶基因檢測，結果發(fā)現(xiàn)3株待測菌均攜帶blaNDM-1基因，而其他7種耐藥基因包括肺炎克雷伯菌中最常見的blaKPC基因均未檢出，說明產NDM-1型碳青霉烯酶是這3株細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥最主要的機制。從病史資料來看，患者全身總燒傷面積達97%，機體免疫力低下，且全身存在多處插管，可引起患者全身多處感染。有學者認為，抗生素的使用尤其是不合理使用是NDM-1酶出現(xiàn)的首要原因。該患者自入院以來，長期使用多種抗生素，包括左氧氟沙星、頭孢他啶、美羅培南、亞胺培南、阿米卡星、萬古霉素、替加環(huán)素及各種抗真菌藥等，在抗生素選擇壓力下可能篩選出該耐藥菌株?，F(xiàn)有研究表明，NDM-1一般不水解氨曲南等單環(huán)β-內酰胺類抗生素，然而超過80%的產NDM-1的細菌同時攜帶其他可以水解氨曲南的耐藥基因，如CTX-M或CMY類ESBLs，從而導致其對氨曲南耐藥[5]。本研究中的3株菌對氨曲南均耐藥，可能與這一機制相關。另外，比較這3株菌的藥敏結果，發(fā)現(xiàn)慶大霉素和妥布霉素從開始的敏感變?yōu)槟退?，查閱病史資料，發(fā)現(xiàn)患者從入院開始到檢出KP1之間間斷使用氨基糖苷類抗生素抗感染，推測其耐藥原因可能是抗生素使用導致，具體機制有待進一步研究。有資料顯示，相比于阿米卡星，慶大霉素及妥布霉素更易出現(xiàn)耐藥[6]。

這3株攜帶blaNDM-1基因細菌的金屬酶表型篩查均為陽性，但是改良Hodge試驗均為陰性。文獻報道，改良Hodge試驗對KPC和OXA-48型碳青霉烯酶檢測敏感性高，但對NDM型酶的檢測敏感性低，從而易出現(xiàn)假陰性[7]。這可能是本研究中改良Hodge試驗均為陰性的原因。

通過ERIC-PCR分型技術對3株細菌的同源性進行分析，發(fā)現(xiàn)3株菌屬于同一型別，表明該患者是全身多部位的產NDM-1酶肺炎克雷伯菌感染。同時，將本研究的測序結果與MLST數(shù)據(jù)庫內已建立的標準序列進行比對分析，3株肺炎克雷伯菌均為ST17，進一步證實3株菌屬于同一克隆型，說明該患者3個不同部位分離的肺炎克雷伯菌具有相同的同源性。由于該類菌株具有嚴重的耐藥性和傳播能力，應引起臨床高度重視。做好細菌耐藥及院內感染防控工作，提高抗生素合理使用水平，加強攜帶blaNDM-1基因細菌的監(jiān)測，一旦發(fā)現(xiàn)疑似或確診產NDM-1酶細菌感染或定植患者應予以隔離，以預防耐藥菌廣泛傳播。

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(本文編輯：周萬青，劉群)

Drug resistant mechanism and homology analysis of carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniaeisolated from different sites of one patient

HUYong-meia,ZOUMing-xianga,LIJuna,DOUQing-yab,WANGHai-chena,YANQuna,LIUWen-ena

(a.DepartmentofClinicalLaboratory,b.InfectionControlCenter,XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410008,Hunan,China)

Objective To investigate the drug resistant mechanism and homology of three strains of carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae(K.pneumoniae) isolated from different sites of one patient. Methods Three strains of carbapenem-resistantK.pneumoniaewere isolated from femoral vein catheter tip, wound secretions and sputum of a patient with severe burns, respectively. Their carbapenemase, metallo-β-lactamase (MBL) and drug resistance genes were detected by modified Hodge test, double-disk synergy test and combination disk diffusion and PCR, respectively, and homology and biological typing were analyzed by enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR (ERIC-PCR) assay and multilocus sequence typing (MLST) technology, respectively. Results The carbapenemase and MBL of three strains of carbapenem-resistantK.pneumoniaewere negative and positive, respectively. TheblaNDM-1gene was identified from the three strains, but other drug resistance genes such asblaKPC,blaGES,blaIMP,blaSPM,blaVIM,blaGIMandblaOXA-48were not detected. ERIC-PCR showed that three isolates belonged to the same genotype, and MLST showed that they were type ST17. Conclusion CarringblaNDM-1gene is the main cause leading to the drug resistance of three strains of carbapenem-resistantK.pneumoniae, and they belong to the same genotype.

multiple-site infection;Klebsiellapneumoniae; New Delhi metallo-β-lactamase-1; multilocus sequence typing

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.08

湖南省發(fā)改委(湘發(fā)改高技[2012]1493號；湘發(fā)改投資[2014]658號)；湖南省自然科學基金(14JJ7003)。

胡詠梅，1989年生，女，技師，碩士，主要從事細菌耐藥檢測及耐藥機制研究。

鄒明祥，主任技師，碩士研究生導師，E-mail：zoumingxiang@126.com。

R446.5

A

2017-05-20)