路萍，許化溪，蘇兆亮

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與免疫檢驗學(xué)系, 江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江 212001)

·臨床實驗研究·

維持性血透治療的2型糖尿病腎病患者血漿eotaxin-2、sTNFRⅡ等表達(dá)水平與代謝綜合征狀態(tài)的關(guān)系

路萍1,2，許化溪1，蘇兆亮1

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與免疫檢驗學(xué)系, 江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江 212001)

目的 探討維持性血透(MHD)治療的2型糖尿病腎病(DN)患者血漿嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-2(eotaxin-2)、可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅰ、Ⅱ(sTNFRⅠ、Ⅱ)等表達(dá)水平與代謝綜合征(MS)狀態(tài)的關(guān)系。方法 選取接受MHD治療3個月以上且病情穩(wěn)定的DN患者30例，以首次確診且尚未實施任何治療的單純2型糖尿病(T2D)患者和體檢健康者各30例為對照；檢測MS相關(guān)指標(biāo)血壓、腰圍、體質(zhì)指數(shù)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、空腹血糖(FBG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、C反應(yīng)蛋白(CRP)等；AAH-INF-G3抗體芯片法分析40種細(xì)胞因子的表達(dá)水平；Pearson法分析其與MS相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果 DN患者和T2D患者M(jìn)S發(fā)生率分別為88.89%和33.33%。與T2D患者和健康人對照者相比，DN患者有較多的MS危險因素個數(shù)、較高的腰圍和較低的體質(zhì)指數(shù)；血漿eotaxin-2和趨化因子I-309水平升高，同時伴有sTNFRⅠ、Ⅱ的表達(dá)水平升高。Pearson相關(guān)分析提示，血漿eotaxin-2、I-309與MS危險因素TG、FBG及舒張壓(DBP)水平等呈現(xiàn)明顯正相關(guān)。此外，血漿sTNFRⅡ和I-309表達(dá)水平均與CRP水平呈顯著正相關(guān)。結(jié)論 MHD治療的DN患者機(jī)體內(nèi)存在著消耗性MS微炎癥狀態(tài)。糖脂代謝的異常影響機(jī)體的免疫生理狀態(tài)，造成免疫炎癥微環(huán)境。eotaxin-2、I-309可能參與這種微炎癥狀態(tài)的慢性化、持續(xù)化，并進(jìn)一步通過sTNFRⅠ、Ⅱ的上調(diào)而加重腎臟損傷，導(dǎo)致MHD治療的DN患者M(jìn)S狀態(tài)的形成。

糖尿病腎??；代謝綜合征；嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-2；可溶性腫瘤壞死因子受體

糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎臟病預(yù)后最差的基礎(chǔ)疾病。代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)是以腹型肥胖、糖耐量異常、胰島素抵抗、血脂異常及高血壓為特征的一組臨床綜合征[1]，在糖尿病腎病患者體內(nèi)普遍存在著MS的多個危險因素組分[2-3]。本研究以維持性血透(maintenance hemodialysis, MHD)治療的2型糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)為研究對象，分析其糖脂代謝異常與發(fā)生MS的炎癥微環(huán)境的關(guān)系，為進(jìn)一步了解此類疾病及其并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)制積累數(shù)據(jù),為預(yù)防和早期干預(yù)以及有效減少并發(fā)癥尋找理論依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 選取2013年11月至2015年1月在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院人工腎規(guī)律血液透析治療超過3個月的穩(wěn)定的DN患者30例(DN組)，男25例，女5例，年齡(54.20±6.63)歲；初診尚未進(jìn)行治療的單純2型糖尿病(type 2 diabetes, T2D)患者30例(T2D組)，男22歲，女8歲，年齡(53.87±12.20)歲；同期門診體檢健康者30例(N組)，男23例，女7例，年齡(51.17±6.42)歲。所有受試者均排除風(fēng)濕、結(jié)締組織疾病、多囊腎、泌尿系梗阻、腫瘤及其他慢性消耗性疾病?；颊咔宄靠崭共裳?，血漿樣本凍存?zhèn)溆谩１狙芯拷?jīng)醫(yī)院倫理委員會審議通過，所有受試對象自愿參加并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 MS相關(guān)指標(biāo)檢測 所有調(diào)查對象清晨空腹測定身高、體重，先靜坐放松10 min，然后用汞柱式血壓計測定血壓3次，每次間隔1 min，以Korotkoff第1音為收縮壓(SBP)，第5音為舒張壓(DBP,缺乏此音時按第4音記錄)，取3次測量水平的平均值作為其血壓值。腰圍(WC)在清晨空腹、立位、自然呼吸狀態(tài)下測定，取肋弓下緣與髂嵴之連線中點，皮尺測量水平周徑2次的平均值。體質(zhì)指數(shù)(body mass index, BMI)計算公式：BMI=體重(kg)/身高(m)2。生化指標(biāo)測定用AU5800全自動生化儀(美國Beckman公司)進(jìn)行。以酶比色法測定三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)，試劑由上海榮盛公司提供；直接法測定高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，試劑由紹興美迪康公司提供；己糖激酶法測定空腹血糖(FBG)，試劑由北京萬泰德瑞公司提供。用Astep全自動特定蛋白分析儀及配套試劑盒(深圳國賽公司)以散射比濁法測定C反應(yīng)蛋白(CRP)。

1.2.2 MS診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)2005年美國國家膽固醇教育計劃成人治療組第3次指南(American Cholesterol Education Program-Adult Treatment PaneⅢ,ATPⅢ)修訂標(biāo)準(zhǔn)對MS的定義[4]，符合以下3項及以上者即為MS。(1)中心性肥胖：腰圍≥102 cm(華人男性為90 cm)或≥88 cm(華人女性為80 cm)；(2)高水平TG：TG≥1.7 mmol/L或已接受藥物治療；(3)低水平HDL-C：HDL-C<1.03 mmol/L(男)或<1.3 mmol/L(女)，或已接受藥物治療；(4)血壓異常：SBP≥130 mmHg或DBP≥85 mmHg,或已接受藥物治療；(5)FBG異常：FBG≥5.6 mmol/L或已接受藥物治療。并按照上述標(biāo)準(zhǔn)對受試對象的5個MS危險因素的個數(shù)進(jìn)行計數(shù)。

1.2.3 抗體芯片法檢測各種炎癥因子 用人類細(xì)胞因子AAH-INF-G3抗體芯片(美國RayBiotech公司)分析40種血漿炎癥因子，按說明書操作，靈敏度達(dá)到pg/mL等級。應(yīng)用InnoScan 300 Microarray Scanner激光掃描儀(法國Innopsys公司)掃描(掃描參數(shù)：波長532 nm；分辨率10 μm)，并經(jīng)芯片分析軟件獲得熒光信號強(qiáng)度。檢測中，各項質(zhì)控指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)。芯片上各種細(xì)胞因子抗體的點陣分布見圖1A，陽性對照點(POS)均能清晰顯示，陰性對照點(NEG)均未有信號檢出，所測熒光信號值需去除背景信號值后進(jìn)行標(biāo)化。

2 結(jié)果

2.1 ATPⅢ診斷標(biāo)準(zhǔn)下3組受試對象MS的發(fā)生率及MS相關(guān)指標(biāo)比較 MHD治療的DN患者和單純T2D患者M(jìn)S發(fā)生率分別為88.89%和33.33%。與健康人對照組相比，MHD治療的DN組患者有較高的WC、CRP、FBG、SBP、DBP及MS危險因素個數(shù)，較低的BMI、HDL-C水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與T2D組相比，MHD治療的DN組的CRP、SBP水平升高并具較高的MS危險因素個數(shù)，而BMI、血糖和TG水平則降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.2 DN患者細(xì)胞因子檢測結(jié)果 與健康人對照和T2D組相比，MHD治療的DN患者血漿可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅰ、Ⅱ(sTNFRⅠ、sTNFRⅡ)、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-2(eotaxin-2/CCL24)和重組人趨化因子I-309(I-309/CCL1)的熒光信號強(qiáng)度明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP-10)熒光信號強(qiáng)度較健康人對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖1。

2.3 DN患者eotaxin-2、 sTNFRⅡ等炎癥因子熒光信號強(qiáng)度與MS相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析 MHD治療的DN患者血漿eotaxin-2水平與TG、FBG、TC、LDL-C水平呈明顯正相關(guān)(r=0.760、0.539、0.557、0.442，P均<0.05)；I-309與DBP、LDL-C水平呈現(xiàn)明顯正相關(guān)(r=0.362、0.431，P均<0.05)；此外，sTNFRⅡ和I-309表達(dá)水平均與CRP水平呈顯著正相關(guān)(r=0.437、0.696，P均<0.05)，兩者之間也呈明顯的正相關(guān)(r=0.687,P<0.01)。

注：A，AAH-INF-G3抗體芯片檢測的40種目標(biāo)因子排布,POS為陽性對照點,NEG為陰性對照點；B，AAH-INF-G3抗體芯片檢測結(jié)果。

圖1 3組受試對象有意義細(xì)胞因子熒光信號強(qiáng)度比較

注：與健康人對照組比較，**P<0.01；與單純2型糖尿病組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

表2 3組受試對象有意義炎癥因子熒光信號強(qiáng)度比較

注：與健康人對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與單純2型糖尿病組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3 討論

影響MHD治療的DN患者長期生活質(zhì)量及預(yù)后的主要因素為患者的基礎(chǔ)身體狀態(tài)及其并發(fā)癥狀況。如何及時、有效、有針對性地改善患者的基礎(chǔ)狀態(tài)并對并發(fā)癥進(jìn)行處理，臨床意義重大。近年來，在糖尿病、代謝綜合征、慢性腎臟病等慢性進(jìn)展性疾病中均發(fā)現(xiàn)慢性微炎癥狀態(tài)[5-6]。接受MHD治療的DN患者同時具有上述各類疾病的表現(xiàn)，其臨床治療更具復(fù)雜性。本研究表明，MHD治療的2型DN患者與初診單純T2D患者和健康人對照者相比，出現(xiàn)明顯的消耗性代謝綜合征狀態(tài)，主要表現(xiàn)為較多的MS危險因素個數(shù)、高WC和低BMI。

T2D是一類糖脂代謝異常性疾病，免疫代謝的概念給進(jìn)一步了解和闡明T2D的發(fā)生發(fā)展提供了新的思路[7]。蛋白質(zhì)抗體芯片技術(shù)是一種高通量的蛋白功能分析技術(shù)，能短時、高效、同步完成多種因子的檢測，其強(qiáng)大的信息量使研究者更全面了解各因子之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。鑒于此，本研究用AAH-INF-G3抗體芯片技術(shù)對MHD治療的DN和T2D患者血漿40種細(xì)胞因子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)血漿eotaxin-2和I-309水平升高，同時伴有sTNFRⅠ、Ⅱ的表達(dá)水平升高，IP-10在DN組表達(dá)水平升高，相關(guān)性分析表明，MHD治療的DN患者血漿eotaxin-2和I-309水平分別與MS相關(guān)指標(biāo)TG、FBG、DBP等水平呈現(xiàn)明顯正相關(guān)。此外，血漿sTNFRⅡ和I-309水平均與反映病原微生物急性感染的標(biāo)志物CRP水平呈顯著正相關(guān)。近年研究表明，慢性腎功能不全患者血清TNF-α及其受體sTNFRⅠ、Ⅱ表達(dá)水平顯著升高，并參與其免疫損傷的病理過程[8-9]，趨化因子IP-10則趨化TH1淋巴細(xì)胞的分化，導(dǎo)致臨床微炎癥狀態(tài)的形成，這與本研究發(fā)現(xiàn)的MHD治療的DN患者sTNFRⅠ、Ⅱ、IP-10水平升高相一致。

Libetta等[10]研究發(fā)現(xiàn)終末期腎臟病患者存在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡，表現(xiàn)為TH2型細(xì)胞優(yōu)勢，eotaxin-2、I-309是TH2型細(xì)胞因子的2種趨化因子的配體，可通過募集及趨化TH2型淋巴細(xì)胞到達(dá)氣道炎癥區(qū)域，參與支氣管哮喘、變應(yīng)性鼻炎、鼻息肉等多種過敏及慢性炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展。由此推測，MHD治療的DN患者可因糖脂代謝的異常影響機(jī)體的免疫生理狀態(tài)，形成免疫損傷造成免疫炎癥微環(huán)境，eotaxin2、I-309參與了這種微炎癥狀態(tài)的慢性化、持續(xù)化，并進(jìn)一步通過sTNFRⅠ、Ⅱ的上調(diào)而加重腎臟損傷,導(dǎo)致維持性血透治療2型糖尿病腎病患者代謝綜合征狀態(tài)形成。

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(本文編輯：劉群)

Correlations of plasma eotaxin-2, sTNFR Ⅱ and other cytokines levels with the status of metabolic syndrome in type 2 diabetic nephropathy patients treated with maintenance hemodialysis

LUPing1,2,XUHua-xi1,SUZhao-liang1

(1.DepartmentofImmunology,SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu; 2.DepartmentofNephrology,theAffiliatedPeople′sHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212001,Jiangsu,China)

Objective To investigate the correlations of plasma eotaxin-2, soluble tumor necrosis factor receptor(sTNFR) Ⅱ and other cytokines levels with the status of metabolic syndrome(MS) in type 2 diabetic nephropathy(DN) patients treated with maintenance hemodialysis(MHD). Methods Thirty type 2 DN patients with stable pathogenetic conditions and MHD treatment for more than 3 months, thirty newly diagnosed and untreated type 2 diabetes(T2D) patients and thirty healthy volunteers were enrolled in the study. The MS related markers, including blood pressure, waist circumference, body mass index, triglyceride(TG), high density lipoprotein cholesterol(HDL-C), fasting blood glucose(FBG), total cholesterol(TC), low density lipoprotein cholesterol(LDL-C) and C reactive protein(CRP), were determined. The expression levels of 40 cytokines were detected with the AAH-INF-G3 antibody microarray, and their correlations with MS related markers were analyzed by the Pearson method. Results The incidence rates of MS in DN patients with MHD and T2D patients were 88.89% and 33.33%, respectively. Compared with T2D patients and healthy controls, the DN patients had more MS related markers, higher waist circumference and lower body mass index, and their plasma eotaxin-2, I-309 and sTNFRⅠ/Ⅱ levels increased significantly. Pearson correlation analysis showed that plasma eotaxin-2 and I-309 levels were positively related to MS risk factors such as TG, FBG and diastolic blood pressure(DBP) levels. Plasma sTNFR Ⅱ and I-309 levels were significantly positively correlated with plasma CRP levels. Conclusion A micro inflammatory state exists in type 2 DN patients with MHD. Abnormal glycolipid metabolism may influence on the immunologic and physiological state of human body, and then form the micro inflammatory state. Eotaxin-2 and I-309 may participate in this chronic and persistent process and further induce renal damage by upregulating sTNFR Ⅰ/Ⅱ levels, which may result in the formation of MS state in type 2 DN patients with MHD.

diabetic nephropathy; metabolic syndrome; eotaxin-2; soluble tumor necrosis factor receptor

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.07

鎮(zhèn)江市2014年度社會發(fā)展科技支撐項目(SH2014051)；江蘇省檢驗醫(yī)學(xué)重點實驗室開放基金項目(JSKLM-2014-012)；江蘇省重點研發(fā)計劃項目(BE2016716)。

路萍，1980年生，女，博士研究生，副主任醫(yī)師，從事血液凈化基礎(chǔ)與臨床工作，E-mail：lp8012@163.com。

R692.5

A

2017-03-13)