彭陽(yáng)，許超，王玉月，何彩珍，許昕，毛易捷，史偉峰

(蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州 213003)

·臨床檢驗(yàn)技術(shù)研究·

絲狀真菌的快速鑒定及藥敏試驗(yàn)

彭陽(yáng)，許超，王玉月，何彩珍，許昕，毛易捷，史偉峰

(蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州 213003)

目的 評(píng)估基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)在絲狀真菌鑒定中的作用，分析常用抗菌藥物對(duì)絲狀真菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果。方法 收集100株絲狀真菌，采用MALDI-TOF MS進(jìn)行快速鑒定，并與顯微鏡檢查結(jié)果進(jìn)行比對(duì)；用E-test法進(jìn)行絲狀真菌藥敏試驗(yàn)。結(jié)果 MALDI-TOF MS對(duì)100株絲狀真菌鑒定達(dá)到種鑒定水平的有61株(得分≥2.000)，達(dá)到屬鑒定水平的有36株(1.700～1.999)，未能鑒定的有3株(<1.700)；與鏡檢結(jié)果不一致的有1株。兩性霉素B對(duì)絮狀表皮癬菌的90%最低抑菌濃度(MIC90)為0.19 μg/mL，而對(duì)黃曲霉的MIC90>32 μg/mL。伊曲康唑?qū)喟l(fā)毛癬菌、犬小孢子菌和絮狀表皮癬菌的MIC90均<0.38 μg/mL，而對(duì)黑曲霉的MIC90>32 μg/mL。氟康唑?qū)Υ蟛糠质茉嚲甑腗IC90均>256 μg/mL。伏立康唑和卡泊芬凈對(duì)煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、紅色毛癬菌、斷發(fā)毛癬菌和犬小孢子菌的MIC90分別≤0.38 μg/mL和≤1 μg/mL。結(jié)論 MALDI-TOF MS技術(shù)可快速、準(zhǔn)確、高通量檢測(cè)臨床分離的絲狀真菌。伏立康唑和卡泊芬凈對(duì)絲狀真菌具有較好的抗菌活性。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；絲狀真菌；真菌藥敏試驗(yàn)

近年來，由于器官移植、免疫抑制劑使用、侵入性治療、惡性腫瘤、HIV感染等患者逐年增多，以及廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，絲狀真菌的感染比例呈上升趨勢(shì)。很多絲狀真菌生長(zhǎng)緩慢，傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣且鑒定能力有限[1-2]，給臨床早期診斷和抗真菌治療帶來困難?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是近年來發(fā)展起來的一種新的鑒定技術(shù)，具有敏感性高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可快速、準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌和真菌[3-5]。目前國(guó)際上對(duì)于抗真菌體外藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果的判讀缺乏解釋標(biāo)準(zhǔn)，通常用50%最低抑菌濃度(50% minimal inhibitory concentration, MIC50)和MIC90來反映抗真菌藥物的活性。本研究主要評(píng)估MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定多種絲狀真菌的性能，并應(yīng)用E-test法檢測(cè)伊曲康唑等5種抗真菌藥物對(duì)絲狀真菌的抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 實(shí)驗(yàn)所用菌株有100株。標(biāo)準(zhǔn)菌19株，包括煙曲霉(ATCC 3626)、黃曲霉(CBS13161)、土曲霉(ATCC 3633)、黑曲霉[CMCC(F)A3]、雜色曲霉(CBS 245.65)、構(gòu)巢曲霉[CMCC(F)A7a]、溜曲霉[CMCC(F)A13]、棒曲霉[CMCC(F)A4a]、薛氏曲霉[CMCC(F)A28]、構(gòu)巢曲霉[CMCC(F)A7]、焦曲霉[CMCC(F)A15a]、紅色毛癬菌(ATCC 4438)、斷發(fā)毛癬菌(CBS 171.65)、球孢白漿菌[CMCC(F)B13b]、馬爾尼菲藍(lán)狀菌[CMCC(F)B33r]、產(chǎn)黃青霉[CMCC(F)B31]、淡紫擬青霉(CMCC 35539)、小孢根霉[CMCC(F)B46]、石膏樣小孢子菌(CBS 118893)和申克孢子絲菌(ATCC 49.12)各1株，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)真菌保藏中心；臨床分離菌株共81株，包括煙曲霉19株，黃曲霉14株，黑曲霉4株，紅色毛癬菌22株，絮狀表皮癬菌5株，犬小孢子菌5株，斷發(fā)毛癬菌5株，石膏樣小孢子菌5株，申克孢子絲菌2株，來自蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院、南京軍區(qū)總醫(yī)院和江蘇省人民醫(yī)院。

1.2 儀器與試劑 Microflex質(zhì)譜儀(德國(guó)布魯克公司)。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、棉藍(lán)染色液(珠海貝索公司)，無水乙醇、乙腈及甲酸(Sigma公司)。氟康唑(FCA)、兩性霉素B(AMB)、伏立康唑(VRC)、伊曲康唑(ITR)和卡泊芬凈(CAS)5種E-test藥敏紙片(鄭州安圖生物公司)，真菌藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基(溫州康泰公司)。

1.3 絲狀真菌鑒定

1.3.1 棉藍(lán)染色檢查 將絲狀真菌點(diǎn)種在PDA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)4～10 d，取一清潔載玻片，滴加棉藍(lán)染液1滴，然后挑取少許培養(yǎng)物于其中，用接種針將其攤開，加蓋玻片微微加溫并稍壓以除去氣泡，在顯微鏡下觀察孢子和分生孢子的形態(tài)、生長(zhǎng)方式及菌絲特征，同時(shí)結(jié)合菌落生長(zhǎng)速度、形態(tài)、質(zhì)地和顏色等進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.3.2 質(zhì)譜儀鑒定 將絲狀真菌點(diǎn)種在PDA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d，挑取少量微生物培養(yǎng)物于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，然后置于搖床內(nèi)28 ℃增菌培養(yǎng)，曲霉屬培養(yǎng)24 h，非曲霉屬培養(yǎng)48 h，取出離心2 min，收集沉積樣本移入Ep管中，13 000 r/min離心2 min，吸棄上清液，向離心管中添加1 mL去離子水，漩渦振蕩1 min，13 000 r/min離心2 min，吸棄上清液，向沉淀中加入300 μL去離子水渦旋，再加入900 μL無水乙醇渦旋，13 000 r/min離心2 min，棄上清液，在超凈臺(tái)中干燥2 min；根據(jù)沉淀的體積，按比例加入適量的70%甲酸溶液，充分混勻后加等體積乙腈溶液并充分混勻，13 000 r/min離心2 min。吸取1 μL上清液點(diǎn)在MALDI靶板上，待液滴干燥后取1 μL基質(zhì)溶液(50%乙腈、2.5%三氟乙酸和α-氰基-4-羥基肉桂酸飽和溶液)覆蓋其上，在室溫下晾干，用質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。使用FlexControl 3.0 軟件采集圖譜，采用正線性模式，激光頻率為60 Hz，加速電壓19.98 kV，延遲提取電壓17.98 kV，聚焦電壓5.99 kV，延遲時(shí)間為150 ns，每個(gè)靶點(diǎn)設(shè)激光隨機(jī)射擊6個(gè)點(diǎn)，每次射擊40次。用MALDI Biotyper 3.0系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得出鑒定結(jié)果。鑒定得分在2.000～3.000之間表示準(zhǔn)確鑒定到種, 1.700～1.999表示鑒定到屬,0.000～1.699表示不能可靠鑒定。每株菌點(diǎn)3 個(gè)靶點(diǎn)，進(jìn)行平行檢測(cè)，取評(píng)分最高的點(diǎn)計(jì)入數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.4 抗真菌藥物敏感性測(cè)定

1.4.1 菌懸液的制備 將絲狀真菌點(diǎn)種在PDA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)7 d，用無菌生理鹽水沖洗菌落表面的菌絲和孢子。將含有菌絲和孢子的沖洗液靜置5～10 min，去除沉淀的顆粒，取上層液體渦旋15 s成孢子懸液。將曲霉屬孢子懸液用生理鹽水調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝唬乔规咦討乙赫{(diào)至0.5～1.0麥?zhǔn)蠞岫葐挝弧?/p>

1.4.2 E-test真菌藥敏試驗(yàn) 挑選79株絲狀真菌，包括19株煙曲霉、14株黃曲霉、5株黑曲霉、18株紅色毛癬菌、5株絮狀表皮癬菌、5株犬小孢子菌和6株斷發(fā)毛癬菌以及構(gòu)巢曲霉、土曲霉、溜曲霉、棒曲霉、焦曲霉、雜色曲霉、石膏樣小孢子菌各1株，采用E-test方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。操作及結(jié)果判讀方法按照說明書進(jìn)行。質(zhì)控菌為近平滑念珠菌(ATCC 22019)。

2 結(jié)果

2.1 絲狀真菌鑒定結(jié)果 絲狀真菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～10 d后菌落形態(tài)較典型，見圖1。曲霉屬菌落生長(zhǎng)較快，結(jié)構(gòu)相對(duì)疏松，不同的曲霉菌可產(chǎn)生不同顏色的色素，如黃曲霉表面呈灰綠色，背面無色或略呈褐色；黑曲霉表面為黑色，呈粉末狀；煙曲霉開始為白色，2～3 d后轉(zhuǎn)為綠色，數(shù)日后變?yōu)樯罹G色并呈粉末狀；土曲霉表面為淡褐色或褐色；雜色曲霉顏色有數(shù)環(huán)，從青綠到紅綠，呈絨毛狀。青霉屬菌落生長(zhǎng)速度較曲霉菌屬慢，一般需培養(yǎng)7 d左右，可產(chǎn)生色素，如產(chǎn)黃青霉菌質(zhì)地絨狀，有輻射狀皺紋，邊緣菌絲體白色，菌落反面呈淺黃褐色；馬爾尼菲藍(lán)狀菌在30 ℃時(shí)呈現(xiàn)為菌絲型，并可產(chǎn)生紅色色素，而在37 ℃時(shí)則為酵母型，不產(chǎn)生色素。申克氏孢子絲菌為雙相型真菌性，在25 ℃時(shí)呈菌絲狀，表面有皺紋，顏色從白色轉(zhuǎn)成深棕色，在37 ℃時(shí)則呈灰棕色酵母菌狀。皮癬菌屬一般于第2～4天開始有菌落生長(zhǎng)，第7～12天菌落較快生長(zhǎng)，除了可產(chǎn)生特征性色素的菌株如紅色毛癬菌、紫色毛癬菌外，大多呈白色絨毛狀，肉眼較難區(qū)分。根霉菌屬一般會(huì)從中心向周圍輻射生長(zhǎng)成圓形菌落，初形成時(shí)為灰白色或黃白色，成熟后變成黑色，生長(zhǎng)迅速的菌株可在2～3 d長(zhǎng)滿整個(gè)平板。100株絲狀真菌的MALDI-TOF MS鑒定得分：評(píng)分≥2.000，達(dá)到種鑒定水平的有61株；1.700～1.999，達(dá)到屬水平的有36株；<1.700的有3株，見表1。19株標(biāo)準(zhǔn)菌株中，棉藍(lán)染色鏡檢結(jié)果與質(zhì)譜鑒定結(jié)果相符合的有15株；質(zhì)譜鑒定無結(jié)果的有3株，分別為薛氏曲霉[CMCC(F)A28]、球孢白漿菌[CMCC(F)B13b]和馬爾尼菲藍(lán)狀菌[CMCC(F)B33r]；與質(zhì)譜鑒定結(jié)果不相符的有1株，為產(chǎn)黃青霉[CMCC(F)B31]。質(zhì)譜鑒定標(biāo)準(zhǔn)菌株的準(zhǔn)確率為78.95%(15/19)。81株常見臨床分離菌株中，棉藍(lán)染色鏡檢結(jié)果與質(zhì)譜結(jié)果均相符合。

注：A，煙曲霉；B，黃曲霉；C，黑曲霉；D，棒曲霉；E，構(gòu)巢曲霉；F，雜色曲霉；G，馬爾尼菲藍(lán)狀菌；H，申克孢子絲菌；I，石膏樣小孢子菌；J，小孢根霉；K，產(chǎn)黃青霉菌；L，斷發(fā)毛癬菌。

圖1 12種絲狀真菌菌落形態(tài)

2.2 E-test藥敏試驗(yàn)結(jié)果 79株絲狀真菌采用E-test方法檢測(cè)藥敏試驗(yàn)。對(duì)于曲霉屬等生長(zhǎng)較快的絲狀真菌24 h即可判讀結(jié)果，而對(duì)于申克孢子絲菌、石膏樣小孢子菌、犬小孢子菌、毛癬菌屬則需48～96 h才能判讀。兩性霉素B對(duì)絮狀表皮癬菌的MIC90為0.19 μg/mL，而對(duì)黃曲霉的MIC90>32 μg/mL。伊曲康唑?qū)喟l(fā)毛癬菌、犬小孢子菌和絮狀表皮癬菌的MIC90均<0.38 μg/mL，而對(duì)黑曲霉的MIC90>32 μg/mL。氟康唑?qū)Υ蟛糠质茉嚲甑腗IC90均>256 μg/mL；伏立康唑和卡泊芬凈對(duì)煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、紅色毛癬菌、斷發(fā)毛癬菌和犬小孢子菌的MIC90分別≤0.38 μg/mL和≤1 μg/mL。見表2。

表2 79株絲狀真菌體外藥敏結(jié)果

3 討論

絲狀真菌的鑒定方法包括直接鏡檢法、血清學(xué)方法、組織病理學(xué)檢查、分子生物學(xué)方法等。其中絲狀真菌形態(tài)學(xué)鑒定需要數(shù)天的時(shí)間對(duì)菌落的生長(zhǎng)速度、色素變化及鏡下菌絲和孢子結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，要求檢驗(yàn)人員有專業(yè)的技術(shù)和豐富的鑒定經(jīng)驗(yàn)，易產(chǎn)生較大的人為誤差；組織病理學(xué)檢查和血清學(xué)方法不能將絲狀真菌鑒定到種的水平；分子生物學(xué)方法對(duì)操作人員技術(shù)要求高,操作復(fù)雜，費(fèi)用昂貴,且對(duì)于一些基因序列高度同源的真菌如黃曲霉和米曲霉不能很好地區(qū)分，亦不適合成為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的檢測(cè)方法。近年來，MALDI-TOF MS技術(shù)已廣泛用于酵母菌的鑒定，操作簡(jiǎn)便、快速、高通量、成本低廉，且準(zhǔn)確性高，臨床應(yīng)用取得良好效果[6]，因此我們選用質(zhì)譜儀鑒定法對(duì)21種絲狀真菌進(jìn)行鑒定，同時(shí)與棉藍(lán)染色檢查的鑒定結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。目前，此技術(shù)并未普及至絲狀真菌的鑒定，主要是因?yàn)榻z狀真菌的胞壁堅(jiān)韌、難以破碎，常規(guī)處理方法難以提取出足量的蛋白質(zhì)。真菌蛋白質(zhì)的提取方法包括勻漿法、研磨法、超聲破碎法及酶溶法等。有研究表明玻璃珠研磨法和超聲破碎法可提高真菌蛋白質(zhì)的分離效率[7-8]?？紤]到玻璃珠研磨法操作復(fù)雜、超聲破碎法成本高且熱效應(yīng)太大等缺點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了液體培養(yǎng)的方法，對(duì)絲狀真菌進(jìn)行甲酸萃取等特殊處理，有助于快速、簡(jiǎn)便地提取更多的蛋白質(zhì)。此外，本研究菌株種類多，而Biotyper 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)中包含的絲狀真菌庫(kù)較少，無法滿足臨床需要，因此我們引進(jìn)了布魯克公司提供的最新絲狀真菌數(shù)據(jù)庫(kù)。其涵蓋127種絲狀真菌的圖譜，但仍缺少個(gè)別種類，如本研究鑒定無結(jié)果的薛氏曲霉和馬爾尼菲藍(lán)狀菌。因此，絲狀真菌的數(shù)據(jù)庫(kù)圖譜需繼續(xù)完善。

絲狀真菌進(jìn)行棉藍(lán)染色檢查時(shí)，需要將真菌接種在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)至少7 d至成熟后才能在鏡下看到理想的形態(tài)，而質(zhì)譜儀鑒定法只需將絲狀真菌接種于肉湯中培養(yǎng)24 h即可鑒定，并且可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)菌株，鑒定單株的過程大約需要20 min。由此可見，質(zhì)譜儀鑒定法不僅大大縮短了絲狀真菌鑒定的時(shí)間，而且具有高通量、高準(zhǔn)確性的優(yōu)勢(shì)。按照質(zhì)譜評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，絲狀真菌鑒定達(dá)到種水平的鑒定率為61.00%(61/100)，達(dá)到屬水平為97.00%(97/100)，與國(guó)內(nèi)報(bào)道[9]相似；曲霉菌鑒定達(dá)到種水平的鑒定率為97.83%(45/46)，達(dá)到屬水平為100%(46/46)，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道[4,9]相似。由此可見，質(zhì)譜儀鑒定的方法具有快速、操作簡(jiǎn)便、高通量、成本低廉等優(yōu)勢(shì)，有助于盡早鑒定出真菌類別，提高鑒定速度，尤其在鑒定曲霉菌上優(yōu)勢(shì)更突出。

近年來，新的抗菌藥物如卡泊芬凈、伏立康唑給臨床治療真菌感染提供了更多的選擇，如何有針對(duì)性地選擇抗菌藥物是臨床醫(yī)生最為關(guān)注的問題，而真菌的體外藥敏試驗(yàn)可評(píng)估臨床上常見的真菌對(duì)經(jīng)典和新型抗菌藥物的抗菌活性，為臨床提供一定的藥敏依據(jù)。臨床實(shí)踐中，絲狀真菌的體外藥敏試驗(yàn)方法主要包括美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的M38-A肉湯稀釋法、瓊脂擴(kuò)散法和E-test法。其中CLSI推薦的標(biāo)準(zhǔn)化方案重復(fù)性好，但是操作繁瑣，成本較高，需時(shí)較長(zhǎng)，不適合實(shí)驗(yàn)室常規(guī)運(yùn)用；瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定真菌對(duì)抗真菌藥物的敏感性僅限于定性，目前較少使用。國(guó)外最新研究報(bào)道，E-test法和CLSI推薦的液基稀釋法針對(duì)兩性霉素、卡泊芬凈和伏立康唑等抗真菌藥物藥敏結(jié)果的符合率具有很好的一致性[10]。E-test法不僅具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果易判讀、重復(fù)性好和定量檢測(cè)MIC值等優(yōu)點(diǎn)，而且有成熟的商品供應(yīng)，是我們選擇該方法的重要原因。國(guó)內(nèi)外均有研究報(bào)道E-test法檢測(cè)抗真菌藥物的抗菌活性,但是對(duì)于抗真菌藥物的類別和霉菌種類的選擇依舊存在一定的局限性[11-13]。本實(shí)驗(yàn)利用E-test法檢測(cè)了79株絲狀真菌對(duì)AMB、FCA、ITR、VRC和CAS 5種抗真菌藥物的活性。CLSI對(duì)近平滑念珠菌(ATCC 22019)具有MIC范圍標(biāo)準(zhǔn)，本次質(zhì)控試驗(yàn)結(jié)果在范圍標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)，符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。由于CLSI對(duì)于判斷不同絲狀真菌體外藥敏試驗(yàn)敏感和耐藥的折點(diǎn)尚未明確規(guī)定，我們用MIC50和MIC90來反映5種抗真菌藥物對(duì)不同絲狀真菌的抑菌程度。本研究顯示，兩性霉素B對(duì)多數(shù)絲狀真菌有抗菌活性，對(duì)黃曲霉的MIC90>32 μg/mL，對(duì)土曲霉的MIC>32 μg/mL，與研究報(bào)道的土曲霉對(duì)兩性霉素B天然耐藥，黃曲霉可以出現(xiàn)獲得性耐藥的情況相符[12]；氟康唑?qū)^大多數(shù)絲狀真菌的抗菌活性較弱，提示對(duì)大多數(shù)真菌可能無效；卡泊芬凈對(duì)絕大多數(shù)絲狀真菌有抗菌活性，但在體外藥敏試驗(yàn)中有拖尾現(xiàn)象，圈內(nèi)有菌生長(zhǎng)，可能會(huì)影響結(jié)果的判讀；伏立康唑和伊曲康唑均為三唑類抗真菌藥，對(duì)大多數(shù)絲狀真菌均有抗菌活性，但結(jié)果顯示伏立康唑?qū)z狀真菌的抗菌活性優(yōu)于伊曲康唑。以往兩性霉素常作為抗真菌感染的一線用藥，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明伏立康唑和卡泊芬凈對(duì)絲狀真菌有更好的抗菌活性。此外，需要注意藥敏結(jié)果與臨床療效常遵循的“90-60”原則[14]，即體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果敏感者約有90%臨床療效較好，而耐藥者約有60%仍然對(duì)治療有效，這一規(guī)律說明了體外藥敏試驗(yàn)與臨床療效之間的相關(guān)性。因此，檢驗(yàn)科室需與臨床加強(qiáng)溝通，這就要求我們能夠正確理解藥敏試驗(yàn)結(jié)果的臨床應(yīng)用價(jià)值和局限性，以便更準(zhǔn)確、快速地為臨床篩選藥物。

綜上所述，MALDI-TOF MS技術(shù)可快速、準(zhǔn)確、高通量檢測(cè)臨床分離的絲狀真菌，同時(shí)結(jié)合快速的藥敏試驗(yàn)，便能在很短的治療時(shí)間窗口內(nèi)提供診斷和治療意見，既能夠避免選用天然不敏感的抗真菌藥物以減少臨床藥物治療成本，又能減少了嚴(yán)重感染病患者的住院時(shí)間并降低發(fā)病率和死亡率。E-test法重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，敏感性高，可以為指導(dǎo)臨床醫(yī)師合理選擇用藥及檢測(cè)病原真菌對(duì)抗真菌藥物的耐藥趨勢(shì)等方面提供參考。故推薦MALDI-TOF MS鑒定法和E-test法作為臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)方法。

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(本文編輯：劉群)

Rapid identification and antifungal susceptibility testing of filamentous fungi

PENGYang,XUChao,WANGYu-yue,HECai-zhen,XUXin,MAOYi-jie,SHIWei-feng

(DepartmentofLaboratoryMedicine,theThirdAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Changzhou213003,Jiangsu,China)

Objective To evaluate the application of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS) technology in the identification of filamentous fungi, and analyze the susceptibility of filamentous fungi to commonly used antibiotics. Methods A total of 100 strains of filamentous fungi were collected and identified rapidly by MALDI-TOF MS. The obtained results were compared with those from microscopic examination. The susceptibility of filamentous fungi was detected by the E-test method. Results Among 100 strains of filamentous fungi identified by MALDI-TOF MS, 61 reached to the species level(score≥2.000), 36 to the genus level(score between 1.700 and 1.999), and 3 failed to be identified(score<1.700). There was inconsistent results for one strain of filamentous fungi between MALDI-TOF MS and microscopic examination. The MIC90of amphotericin B againstEpidermophytonfloccosumwas 0.19 μg/mL, while that againstAspergillusflavuswas above 32 μg/mL. The MIC90of itraconazole againstTrichophytontonsurans,MicrosporumcanisandEpidermophytonfloccosumwere all below 0.38 μg/mL, while that againstAspergillusnigerwas above 32 μg/mL. The MIC90of fluconazol were above 256 μg/mL for most of strains. The MIC90of voriconazole and caspofungin againstAspergillusfumigatus,Aspergillusflavus,Aspergillusniger,Trichophytonrubrum,TrichophytontonsuransandMicrosporumcaniswere ≤0.38 μg/mL and ≤1 μg/mL, respectively. Conclusion The MALDI-TOF MS technology may be used to identify the filamentous fungi isolated from clinical specimens quickly, accurately and high-throughput. Voriconazole and caspofungin have effective anti-filamentous fungi activity.

matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry; filamentous fungi; antifungal susceptibility testing

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.02

國(guó)家自然科學(xué)基金(81572052)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20151178)；常州市醫(yī)學(xué)領(lǐng)軍人才項(xiàng)目(20101368)。

彭陽(yáng)，1992年生，女，碩士研究生，主要從事臨床微生物與免疫研究。

史偉峰，主任技師，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：swf67113@163.com。

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2017-06-01)