張 妍，董 琳，雍婧姣，毛福英，尹 蕾，付雪艷#（.寧夏醫(yī)科大學(xué)寧夏回藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，銀川 75000；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)寧夏回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 75000）

HPLC法同時(shí)測定黃芪藥材中10種黃酮類成分的含量Δ

張 妍1，2＊，董 琳1，雍婧姣1，毛福英1，尹 蕾1，付雪艷1#（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)寧夏回藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，銀川 750001；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)寧夏回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750001）

目的：建立同時(shí)測定黃芪藥材中10種黃酮類成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agilent SB-C18，流動(dòng)相為乙腈-0.3%甲酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷、異槲皮苷、染料木苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、槲皮素、染料木素、山柰酚、異鼠李素和芒炳花素檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為0.030 29～1.514 5 μg（r＝0.999 4）、0.015 00～0.7 500 μg（r＝0.999 5）、0.007 39～0.369 5 μg（r＝0.999 1）、0.120 11～6.005 5 μg（r＝0.999 8）、0.038 36～1.918 μg（r＝0.999 9）、0.029 89～1.494 5 μg（r＝0.999 5）、0.007 04～0.352 μg（r＝0.999 4）、0.016 83～0.841 5 μg（r＝0.999 5）、0.004 54～0.227 μg（r＝0.999 9）、0.013 36～0.668 μg（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為99.55%～100.45%（RSD＝0.36%，n＝6）、99.34%～101.00%（RSD＝0.59%，n＝6）、98.05%～100.36%（RSD＝1.27%，n＝6）、99.73%～100.13%（RSD＝0.18%，n＝6）、99.70%～100.30%（RSD＝0.22%，n＝6）、99.67%～103.27%（RSD＝1.37%，n＝6）、98.13%～104.41%（RSD＝2.37%，n＝6）、96.35%～100.06%（RSD＝1.46%，n＝6）、99.47%～101.13%（RSD＝0.60%，n＝6）、99.70%～100.06%（RSD＝0.15%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于黃芪藥材中10種黃酮類成分含量的同時(shí)測定。

黃芪；黃酮類成分；含量測定；高效液相色譜法

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of 10 flavonoids in Astragalus membranaceus. METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Agilent SB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.3%formic acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 254 nm，and the column temperature was 35℃.The sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of calycosin-7-O-glucoside，isoquercitrin，genistin，ononin，calycosin，quercetin，genistein，kaempferol，isorhamnetin and formononetion were 0.030 29-1.514 5 μg（r＝0.999 4），0.015 00-0.7 500 μg（r＝0.999 5），0.007 39-0.369 5 μg（r＝0.999 1），0.120 11-6.005 5 μg（r＝0.999 8），0.038 36-1.918 μg（r＝0.999 9），0.029 89-1.494 5 μg（r＝0.999 5），0.007 04-0.352 μg（r＝0.999 4），0.016 83-0.841 5 μg（r＝0.999 5），0.004 54-0.227 μg（r＝0.999 9），0.013 36-0.668 μg（r＝0.999 9），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.The recoveries were 99.55%-100.45%（RSD＝0.36%，n＝6），99.34%-101.00%（RSD＝0.59%，n＝6），98.05%-100.36%（RSD＝1.27%，n＝6），99.73%-100.13%（RSD＝0.18%，n＝6），99.70%-100.30%（RSD＝0.22%，n＝6），99.67%-103.27%（RSD＝1.37%，n＝6），98.13%-104.41%（RSD＝2.37%，n＝6），96.35%-100.06%（RSD＝1.46%，n＝6），99.47%-101.13%（RSD＝0.60%，n＝6），99.70%-100.06%（RSD＝0.15%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：This method is convenient，sensitive，stable and reproducible，can be used for simultaneous determination of 10 flavonoids in A.membranaceus.

KEYWORDSAstragalus membranaceus；Flavonoids；Content determination；HPLC

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪A.membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根。其味甘，性微溫，歸肺、脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表、利尿消腫、生津養(yǎng)血、托毒排膿、斂瘡生肌等功效，臨床用于氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷、久瀉脫肛、便血崩漏、表虛自汗、氣虛水腫、血虛痿黃、內(nèi)熱消渴等癥[1]。近年研究表明，黃芪主要含黃芪多糖、黃芪皂苷和黃酮類成分，具有增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能、抗心肌缺血、雙向調(diào)節(jié)血壓、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、保肝、抗腫瘤、清除自由基和抗衰老等作用[2-4]；黃芪藥材中黃酮類成分共分離出幾十余種，主要有槲皮素、山柰酚、異鼠李素、羥基異黃酮、異黃烷、蘆丁、芒柄花素、毛蕊異黃酮、染料木苷、染料木素、刺芒柄花苷等[5-6]。本試驗(yàn)采集內(nèi)蒙、山西、河南、甘肅、寧夏等地21批黃芪藥材，利用高效液相色譜法（HPLC）測定了黃芪藥材中10種黃酮類成分的含量，為黃芪藥材的質(zhì)量控制及合理開發(fā)利用資源提供了依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括DAD檢測器（美國Agilent公司）；AL-204型電子分析天平（瑞士Merrler-Toledo公司）、CPA225D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；KQ3200型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：40 kHz）。

1.2 試劑

毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷對照品（批號：14110905）、異槲皮苷對照品（批號：15070211）、染料木苷對照品（批號：15021802）、刺芒柄花苷對照品（批號：15052010）、毛蕊異黃酮對照品（批號：14121511）、槲皮素對照品（批號：15090717）、染料木素對照品（批號：14110908）、山柰酚對照品（批號：14110508）、異鼠李素對照品（批號：14102108）、芒柄花素對照品（批號：15061408）均購自成都思天德生物科技有限公司，純度均＞98%；甲醇、甲酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

21批黃芪藥材均采自不同產(chǎn)地（見表1），經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院董琳博士鑒定為豆科蒙古黃芪A. membranaceus（Fisch.）Bge.var.monghlicu（Bge.）Hsiao的干燥根。

表1 黃芪藥材來源Tab 1 Source ofA.membranaceus

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.3%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，5%→20%A；15～30 min，20%→25%A；30～35 min，25%→30%A；35～40 min，30%A；40～60 min，30%→40%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取各待測成分對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷、異槲皮苷、染料木苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、槲皮素、染料木素、山柰酚、異鼠李素和芒炳花素質(zhì)量濃度分別為30.29、15.00、7.39、120.11、38.36、29.89、7.04、16.83、4.54、13.36 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品約5 g，研細(xì)（過4號篩），精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，放置過夜，50℃下超聲處理1 h，放冷，濾過，濾液濃縮至干，用甲醇溶解并定容至5 mL，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷、異槲皮苷、染料木苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、槲皮素、染料木素、山柰酚、異鼠李素和芒炳花素保留時(shí)間分別為15.6、17.6、18.5、27.7、35.7、36.6、43.4、45.8、47.2、53.4 min，各成分基線分離良好；理論板數(shù)均＞1.5。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液1、5、10、20、50 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and liner ranges

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷、異槲皮苷、染料木苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、槲皮素、染料木素、山柰酚、異鼠李素和芒炳花素峰面積的RSD分別為0.59%、1.10%、0.41%、0.54%、0.94%、0.27%、0.68%、0.61%、0.57%、0.64%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號：3）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、18、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷、異槲皮苷、染料木苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、槲皮素、染料木素、山柰酚、異鼠李素和芒炳花素峰面積的RSD分別為0.06%、0.62%、1.45%、0.15%、0.09%、1.20%、1.31%、1.95%、1.53%、0.77%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（編號：3）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷、異槲皮苷、染料木苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、槲皮素、染料木素、山柰酚、異鼠李素和芒炳花素平均含量分別為2.274 0、0.073 8、0.045 5、1.578 0、1.448 8、0.210 1、0.005 5、0.069 6、0.014 0、0.114 6 mg/g，RSD分別為0.13%、1.75%、1.66%、0.06%、0.07%、0.61%、1.87%、0.96%、0.64%、0.46%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（編號：3）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

2.9 藥材樣品含量測定

取21批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表4。

表4 藥材樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 4 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

黃芪中黃酮類成分較多且呈弱酸性，故采用酸性緩沖系統(tǒng)[7]，本研究考察了乙腈-磷酸、乙腈-甲酸系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)使用甲酸作為抑制劑，黃酮類成分分離良好；此外還考察了不同梯度的流動(dòng)相配比，最終發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動(dòng)相A為乙腈，B為0.3%甲酸溶液，梯度洗脫（0～15 min，5%→20%A；15～30 min，20%→25%A；30～35 min，25%→30%A；35～40 min，30%A；40～60 min，30%→40%A）時(shí)10種黃酮類成分能全部分離，且與相鄰色譜峰的分離度＞1.5，故選其為流動(dòng)相。

3.2 提取方法的選擇

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，超聲法提取黃芪總黃酮比連續(xù)回流提取法具有快速、節(jié)省溶劑、提取的有效成分含量高等優(yōu)點(diǎn)[8]。本試驗(yàn)考察了超聲、浸泡、回流等提取方式，發(fā)現(xiàn)先浸泡過夜后超聲50℃提取60 min，再將提取液濃縮至5 mL時(shí)提取的黃酮類有效成分較多，且提取方法簡單快捷，故采用先浸泡過夜再超聲提取的方法進(jìn)行提取。

3.3 檢測波長的選擇

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，毛蕊異黃酮苷和毛蕊異黃酮在258 nm波長處有最大吸收，在288 nm波長處有肩峰；芒柄花苷和芒柄花素在248 nm波長處有最大吸收，在290 nm波長處有肩峰[9-10]；染料木素及染料木苷在260 nm波長處有最大吸收[11]；槲皮素在255 nm波長處有最大吸收，山柰酚在266 nm波長處有最大吸收[12]。用二極管陣列檢測器全波長（200～400nm）掃描供試品溶液，得出指紋圖譜，依據(jù)色譜圖盡可能的兼顧大部分吸收峰，發(fā)現(xiàn)各成分在254 nm波長處均有較好的峰形和峰面積，故選此波長為檢測波長。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于黃芪藥材中10種黃酮類成分含量的同時(shí)測定。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：302.

[2] 劉德麗，包華音，劉楊.近5年黃芪化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].食品與藥品，2014，16（1）：68-70.

[3] 張薔，高文遠(yuǎn)，滿淑麗.黃芪中有效成分藥理活性的研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2012，37（21）：3203-3207.

[4] 顧檢勇，黃培志.黃茂注射液對脂多糖致大鼠急性肺損傷后細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].中國新藥與臨床雜志，2007，26（3）：212-214.

[5] 田華，鄧雁如，周坤，等.蒙古黃芪的化學(xué)成分研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（7）：70-73.

[6] 羅舟，蘇明智，顏鳴，等.蒙古黃芪的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2012，43（3）：458-462.

[7] 覃紅萍，魯靜，林瑞超，等.黃芪中異黃酮類成分的研究[J].藥物分析雜志，2009，29（5）：746-748.

[8] 孔繁晟，賁永光，孫愛群，等.超聲法與連續(xù)回流法提取黃芪總黃酮的工藝對比研究[J].中國藥房，2010，21（19）：1752-1754.

[9] 王曉輝，劉濤，李清，等.高效液相色譜法同時(shí)測定黃芪中的五種異黃酮類成分[J].色譜，2006，24（5）：486-488.

[10] 蔡海霞，陳君，李萍.一測多評法測定黃芪中4種異黃酮的含量[J].中國中藥雜志，2010，35（5）：2712-2717.

[11] 楊啟明，張春鳳，楊中林.HPLC測定不同產(chǎn)地蔓性千斤拔中染料木苷和染料木素的含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2012，29（8）：744-748.

[12] 石繼亮，單玉，張振秋，等.HPLC法同時(shí)測定黃芪中槲皮素、山柰酚、芒柄花素的含量[J].藥物分析雜志，2010，30（1）：114-116.

Simultaneous Determination of 10 Flavonoids in Astragalus membranaceus by HPLC

ZHANG Yan1，2，DONG Lin1，YONG Jingjiao1，MAO Fuying1，YIN Lei1，F(xiàn)U Xueyan1（1.Ningxia Research Center for Modern Engineering and Technology of Hui Medicine，Ningxia Medical University，Yinchuan 750001，China；2.Ningxia Key Lab of Hui Medicine Modernization，Ministry of Education，Ningxia Medical University，Yinchuan 750001，China）

R917

A

1001-0408（2017）21-2970-04

2016-08-27

2016-10-11）

（編輯：張 靜）

寧夏自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.NZ14060）

＊助理實(shí)驗(yàn)員，碩士。研究方向：藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高。E-mail：bloom77@163.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：中藥提取分離與結(jié)構(gòu)鑒定。E-mail：fuxueyan1215@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.21.25