崔俊鳳，于志華，劉曉鵬（濱州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東濱州 256600）

HPLC法同時測定白蒲黃片中5種成分的含量

崔俊鳳＊，于志華，劉曉鵬（濱州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東濱州 256600）

目的：建立同時測定白蒲黃片中白頭翁皂苷B4、咖啡酸、黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agela Technologies Venusil XBP C18（L），流動相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（梯度洗脫），流速為0.8 mL/min，檢測波長為203 nm（白頭翁皂苷B4）和323 nm（咖啡酸、黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿），柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：白頭翁皂苷B4、咖啡酸、黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為0.081 41～8.141μg（r＝0.999 8）、0.018 71～1.871μg（r＝0.999 4）、0.037 33～3.733μg（r＝0.999 2）、0.028 85～2.885μg（r＝0.999 6）、0.027 58～2.758μg（r＝0.999 7）；定量限分別為0.009、0.006、0.008、0.011、0.013 ng，檢測限分別為0.030、0.020、0.025、0.034、0.036 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為97.39%～102.34%（RSD＝1.81%，n＝6）、96.77%～98.92%（RSD＝0.85%，n＝6）、97.38%～103.72%（RSD＝2.46%，n＝6）、96.73%～102.01%（RSD＝2.22%，n＝6）、96.47%～101.07%（RSD＝1.61%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于白蒲黃片中白頭翁皂苷B4、咖啡酸、黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿含量的同時測定。

高效液相色譜法；白蒲黃片；白頭翁皂苷B4；咖啡酸；黃芩苷；鹽酸巴馬?。畸}酸小檗堿；含量

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of pulchinenoside B4，caffeic acid，baicalin，palmatine hydrochloride and berberine hydrochloride in Baipuhuang tablets.METHODS：HPLC method was adopted.The determination of Agela Technologies Venusil XBP C18（L）with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05 mol/L monopotassium phosphate（gradient elution）at the flow rate of 0.8 mL/min.The detection wavelengths were set at 203 nm（pulchinenoside B4）and 323 nm（caffeic acid，baicalin，palmatine hydrochloride，berberine hydrochloride）.The column temperature was set at 30℃，and the sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges were 0.081 41-8.141μg for pulchinenoside B4（r＝0.999 8），0.018 71-1.871μg for caffeic acid（r＝0.999 4），0.037 33-3.733μg for baicalin（r＝0.999 2），0.028 85-2.885μg for palmatine hydrochloride（r＝0.999 6）and 0.027 58-2.758μg for berberine hydrochloride（r＝0.999 7）.The limits of quantitation were 0.009，0.006，0.008，0.011，0.013 ng，respectively.The limits of detection were 0.030，0.020，0.025，0.034，0.036 ng，respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.The average recoveries were 97.39%-102.34%（RSD＝1.81%，n＝6），96.77%-98.92%（RSD＝0.85%，n＝6），97.38%-103.72%（RSD＝2.46%，n＝6），96.73%-102.01%（RSD＝2.22%，n＝6）and 96.47%-101.07%（RSD＝1.61%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and reproducibility，and can be used for simultaneous determination of pulchinenoside B4，caffeic acid，baicalin，palmatine hydrochloride and berberine hydrochloride in Baipuhuang tablet.

KEYWORDSHPLC；Baipuhuang tablets；Pulchinenoside B4；Caffeic acid；Baicalin；Palmatine hydrochlorid；Berberine hydrochloride；Content

白蒲黃片主要由白頭翁、蒲公英、黃芩和黃柏4味中藥材組成，具有清熱燥濕、解毒涼血的功效，主要用于大腸濕熱、熱毒壅盛所致的痢疾、泄瀉，癥見里急后重、便下膿血；腸炎、痢疾見上述證候者[1]。白蒲黃片收載于2015年版《中國藥典》（一部）[2]，只規(guī)定了黃芩苷的含量測定項(xiàng)，不能全面地控制該制劑的質(zhì)量，因此筆者采用高效液相色譜法（HPLC）建立了測定該制劑中4種中藥材的主要成分白頭翁皂苷B4、咖啡酸、黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿含量的方法，以期為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Technologies-1260型HPLC儀，包括二極管陣列檢測器、G1329B自動進(jìn)樣器、chenstation色譜工作站（美國Agilent公司）；MS105型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；JK-600DH型恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：600 W，頻率：45 kHz）；TGL-18000-CR型高速臺式冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Milli-Q Advantage A10型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

白蒲黃片（哈爾濱蒲公英藥業(yè)有限公司，批號：160414、160620、160812，規(guī)格：0.3 g/片）；白頭翁皂苷B4對照品（批號：111766-200601，純度：100%）、咖啡酸對照品（批號：110885-201002，純度：100%）、黃芩苷對照品（批號：110715-201318，純度：93.3%）、鹽酸巴馬汀對照品（批號：110732-201510，純度：87.4%）、鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-201212，純度：86.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agela Technologies Venusil XBP C18（L）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，15.0%A； 20～25 min，15.0%→23.0%A；25～53 min，23.0%A；53～54 min，23.0%→15.0%A；54～60 min，15.0%A）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：203 nm（白頭翁皂苷B4）和323 nm（咖啡酸、黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取白頭翁皂苷B4、咖啡酸、黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿對照品各20.352 5、4.677 5、10.002 4、8.251 0、7.953 6 mg，置于同一25 mL量瓶中，加50%甲醇溶液溶解并定容，搖勻，制成白頭翁皂苷B4、咖啡酸、黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度分別為0.814 1、0.187 1、0.373 3、0.288 5和0.275 8 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品10片，除去糖衣，精密稱定，研細(xì)，取約0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加50%甲醇溶液50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，加50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，在4℃下，以半徑為5 cm、8 000 r/min離心10 min，吸取上清液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的處方比例和制備工藝，制備缺白頭翁、蒲公英、黃芩、黃柏的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞2.0；對稱因子在0.95～1.05，理論板數(shù)以黃芩苷峰計(jì)為147 548，保留時間為26.13 min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液0.05、0.1、0.5、2.5、5.0 mL，分別置于5 mL量瓶中，加50%甲醇溶液定容，搖勻，即得系列混合對照品溶液。取上述系列混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以各待測成分的進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時，得LOQ；當(dāng)信噪比為3∶1時，得LOD。結(jié)果，白頭翁皂苷B4、咖啡酸、黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的LOQ分別為0.009、0.006、0.008、0.011、0.013 ng，LOD分別為0.030、0.020、0.025、0.034、0.036 ng。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，白頭翁皂苷B4、咖啡酸、黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.61%、0.93%、0.67%、0.76%和0.42%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號：160414）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，白頭翁皂苷B4、咖啡酸、黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.75%、0.81%、0.94%、0.83%和0.97%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號：160414）適量，除去糖衣，精密稱定，研細(xì)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，白頭翁皂苷B4、咖啡酸、黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量平均值分別為20.132 4、0.256 3、3.256 2、1.542 6、2.547 6 mg/片，RSD分別為0.57%、1.35%、0.93%、0.87%和0.97%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號：160414）適量，除去糖衣，精密稱定，研細(xì)，共6份，各置于50 mL具塞錐形瓶中，加入一定質(zhì)量的白頭翁皂苷B4、咖啡酸、黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，除去糖衣，精密稱定，研細(xì)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

2015年《中國藥典》（一部）中白頭翁皂苷B4的檢測波長為203 nm，咖啡酸為323 nm，黃芩苷為315 nm，而鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿在348 nm波長附近有最大吸收。后4個成分的檢測波長相近，通過預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在323 nm波長處吸收均較好且干擾較少，因此最終確定本試驗(yàn)的檢測波長為203 nm（白頭翁皂苷B4）和323 nm（咖啡酸、黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿）[2-6]。

3.2 流動相的選擇

分別考察了甲醇-0.1%磷酸溶液[7]、乙腈-水[8]、乙腈-0.1%磷酸溶液[9]和乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液[10]為本試驗(yàn)的流動相時對色譜的影響。結(jié)果，甲醇-0.1%磷酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫時，咖啡酸的分離度和對稱性不符合要求；乙腈-水為流動相進(jìn)行梯度洗脫時，鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象；乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫時，白頭翁皂苷B4出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象；乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫時，各色譜峰的分離度均較好。因此，本試驗(yàn)選擇乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動相。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

表3 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/片）Tab 3 Results of content determination of samples（n＝3，mg/tablet）

3.3 超聲處理時間的考察

本試驗(yàn)還比較了超聲處理時間（15、30、45 min）對提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲處理30 min和45 min時的樣品提取率相差不大，均大于15 min時的樣品提取率。綜合考慮時間等因素，最終確定超聲處理時間為30 min[11]。

綜上所述，本方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于白蒲黃片中白頭翁皂苷B4、咖啡酸、黃芩苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿含量的同時測定。

[1]金苗苗，曹亮，杜英峰，等.HPLC-MS法同時測定白蒲黃片中7種五環(huán)三萜皂苷類化學(xué)成分[J].藥物分析雜志，2015，35（6）：986-988.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：104、301-302、305、352-353、797-798.

[3] 馮果，劉文，馮勇.復(fù)方白頭翁湯結(jié)腸緩釋片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（13）：81-85.

[4] 姚志紅，王其意，韋卓純，等.超高效液相色譜法同時測定腫節(jié)風(fēng)中6個成分的含量[J].分析測試學(xué)報(bào)，2016，35（6）：641-647.

[5] 何海雁，張葉，劉宏明.HPLC法同時測定小兒解表顆粒中綠原酸、咖啡酸、葛根素、大豆苷的含量[J].藥學(xué)研究，2016，35（4）：214-216.

[6] 趙煥霞，高山.連蒲雙清片中咖啡酸含量測定的研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，23（5）：37-38.

[7] 楊立志，楊瑞英，姜雪敏.HPLC法測定雙黃連顆粒中連翹苷含量[J].中國藥事，2010，24（8）：754-755.

[8] 宋麗麗，曹穎，李曉霞，等.應(yīng)用HPLC對復(fù)方一清顆粒中黃芩苷含量測定方法的改進(jìn)[J].實(shí)驗(yàn)室科學(xué)，2015，18（2）：10-13.

[9] 丁晴，徐德然.HPLC法同時測定黃柏中鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀及鹽酸小檗堿的含量[J].西北植物學(xué)報(bào)，2004，24（11）：2143-2145.

[10] 鄧六勤，鐘鳴.RP-HPLC法測定黃連上清片中鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿和鹽酸巴馬汀的含量[J].中國藥房，2011，22（16）：1514-1516.

[11] 楊燕飛.RP-HPLC同時測定坤泰膠囊中芍藥苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量[J].中成藥，2010，32（6）：958-960.

（編輯：劉 柳）

Simultaneous Determination of 5 Components in Baipuhuang Tablets by HPLC

CUI Junfeng，YU Zhihua，LIU Xiaopeng（Binzhou Center for Food and Drug Control，Shandong Binzhou 256600，China）

R917

A

1001-0408（2017）21-3007-04

2016-10-28

2017-02-24）

＊主管中藥師。研究方向：藥品檢驗(yàn)檢測和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：0543-8176988。E-mail：yjscjf@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.21.36