鄭 培，湯兵力，林艷珠，馮春艷，刑征宇（海南省食品藥品檢驗(yàn)所?？诜炙？?570216）

UPLC-MS/MS法同時(shí)測定裸花紫珠干浸膏中5種有效成分的含量

鄭 培＊，湯兵力，林艷珠，馮春艷，刑征宇（海南省食品藥品檢驗(yàn)所?？诜炙？?570216）

目的：建立同時(shí)測定裸花紫珠干浸膏中5種有效成分含量的方法。方法：采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。色譜條件：色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18，流動(dòng)相為乙腈-水（梯度洗脫），流速為0.3 mL/min，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為2 μL；質(zhì)譜條件：多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描模式，干燥氣/霧化氣為氮?dú)?，干燥氣溫度?25℃，干燥氣流量為6 L/min，霧化氣壓力為45 psi，鞘流氣溫度為350℃，鞘流氣流量為12 L/min，毛細(xì)管電壓為4 000 V（+）、3 500 V（-），噴嘴電壓為500 V。結(jié)果：木犀草苷、毛蕊花糖苷、槲皮素、木犀草素、蘆丁檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.504 8～252.4 ng/mL（r＝0.999 9）、0.712 4～356.2 ng/mL（r＝0.999 0）、0.509 4～254.7 ng/mL（r＝0.996 2）、0.303 0～151.5 ng/mL（r＝0.999 8）、0.602 2～301.1 ng/mL（r＝0.999 6）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜3.0%；定量限分別為0.42、0.87、0.33、0.12、0.76 ng/mL；加樣回收率分別為97.99%～101.20%（RSD＝1.3%，n＝6）、96.50%～101.20%（RSD＝1.7%，n＝6）、94.81%～99.34%（RSD＝1.7%，n＝6）、97.54%～100.51%（RSD＝1.2%，n＝6）、93.37%～98.70%（RSD＝1.9%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于裸花紫珠干浸膏中5種有效成分含量的同時(shí)測定。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；裸花紫珠干浸膏；木犀草苷；毛蕊花糖苷；槲皮素；木犀草素；蘆丁

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of 5 effective components in Luohua zizhu dry extract.METHODS：UPLC-MS/MS was conducted.The separation was performed on an Zorbax Eclipse Plus C18column with mobile phase of acetonitrile-water（gradient elution）at the flow rate of 0.3 mL/min.The column temperature was set at 40℃and sample size was 2 μL.The analytes were detected in the multiple reaction monitoring（MRM）mode.Nitrogen was used as drying gas and atomized gas.The temperature and flow rate of drying gas were 325℃and 6 L/min.The pressure of atomized gas was 45 psi. The temperature and flow rate of sheath gas were 350℃and 12 L/min.The voltage of capillary were 4 000 V（+）and 3 500 V（-）. The voltage of nozzle was 500 V.RESULTS：The linear ranges of luteoloside，acteoside，quercetin，luteolin and rutin were 0.504 8-252.4 ng/mL（r＝0.999 9），0.712 4-356.2 ng/mL（r＝0.999 0），0.509 4-254.7 ng/mL（r＝0.996 2），0.303 0-151.5 ng/mL（r＝0.999 8）and 0.602 2-301.1 ng/mL（r＝0.999 6），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all less than 3.0%. The limit of quantitation were 0.42，0.87，0.33，0.12，0.76 ng/mL.The recoveries were 97.99%-101.20%（RSD＝1.3%，n＝6），96.50%-101.20%（RSD＝1.7%，n＝6），94.81%-99.34%（RSD＝1.7%，n＝6），97.54%-100.51%（RSD＝1.2%，n＝6），93.37%-98.70%（RSD＝1.9%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，precise，stable and reproducible，and can be used for simultaneous determination of 5 effective components in Luohua zizhu dry extract.

KEYWORDSUPLC-MS/MS；Luohua zizhu dry extract；Luteoloside；Acteoside；Quercetin；Luteolin；Rutin

裸花紫珠干浸膏是由單味裸花紫珠制成浸膏的中成藥；裸花紫珠具有清熱解毒、收斂止血、散瘀消腫的功效，在臨床上主要用于治療術(shù)后、外傷后、藥物流產(chǎn)后、呼吸道和消化道出血后止血，對(duì)化膿性炎癥、燒傷或燙傷的治療效果尤其顯著[1-3]。裸花紫珠主要活性成分為黃酮類，包括木犀草苷、毛蕊花糖苷、槲皮素、木犀草苷、蘆丁等[4-5]。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）建立了快速測定裸花紫珠干浸膏中5種活性成分含量的方法，以期為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1290-6460型UPLC-MS/MS儀（美國Agilent公司）；PL-1001L型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；3-18K型高速離心機(jī)（德國Sigma公司）；KQ-600TDE型超聲波清洗機(jī)（東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司，頻率：80 kHz，功率：700 W）。

1.2 試劑

裸花紫珠干浸膏（海南九芝堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20160101、20160201、20160301，規(guī)格：每1 g干浸膏相當(dāng)于原藥材5 g）；木犀草苷對(duì)照品（批號(hào)：111720-201408）、毛蕊花糖苷對(duì)照品（批號(hào)：111530-201411）、槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：100081-201509）木犀草素對(duì)照品（批號(hào)：111520-200504）、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-201409）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均＞98%；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～9.5 min，20%A；9.5～10.0 min，20%→80%A；10～14 min，80%A；14～15 min，80%→20%A；15～27 min，20%A）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描模式；干燥氣/霧化氣：氮?dú)?；干燥氣溫度?25℃；干燥氣流量：6 L/min；霧化氣壓力：45 psi；鞘流氣溫度：350℃；鞘流氣流量：12 L/min；毛細(xì)管電壓：4 000 V（+）、3 500 V（-）；噴嘴電壓：500 V。標(biāo)準(zhǔn)譜庫信息見表1；總離子流（TIC）、提取離子流（EIC）色譜見圖1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)譜庫信息Tab 1 Standard library information

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取待測成分對(duì)照品適量，精密稱定，分別置于50 mL量瓶中，加70%甲醇溶液定容，制成木犀草苷、毛蕊花糖苷、槲皮素、木犀草素、蘆丁質(zhì)量濃度分別2.524、3.562、2.547、1.515、3.011 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品適量，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加70%甲醇溶液適量，超聲處理20 min，放冷，加70%甲醇溶液定容，搖勻；以離心半徑為8.5 cm、10 000 r/min離心20 min，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置于50 mL量瓶中，加70%甲醇溶液定容，搖勻；精密量取2 mL，置于200 mL量瓶中，加70%甲醇溶液定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

圖1 TIC和EIC色譜圖Fig 1 TIC and EIC chromatograms

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，制成木犀草苷質(zhì)量濃度分別為252.400 0、25.240 0、10.096 0、5.048 0、1.009 6、0.504 8 ng/mL，毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度分別為356.200 0、35.620 0、14.248 0、7.124 0、1.424 8、0.712 4 ng/mL，槲皮素質(zhì)量濃度分別為254.700 0、25.470 0、10.188 0、5.094 0、1.018 8、0.509 4 ng/mL，木犀草素的質(zhì)量濃度分別為151.500 0、15.150 0、6.060 0、3.030 0、0.606 0、0.303 0 ng/mL，蘆丁的質(zhì)量濃度分別為301.100 0、30.110 0、12.044 0、6.022 0、1.204 4、0.602 2 ng/mL的系列混合對(duì)照品溶液。精密量取上述系列混合對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

表2 回歸方程、線性范圍與定量限Tab 2 Regression equations，linear ranges and LOQs

2.4 定量限考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限，詳見表2。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，木犀草苷、毛蕊花糖苷、槲皮素、木犀草素、蘆丁峰面積的RSD為0.8%、1.9%、0.7%、0.6%、1.1%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20160101）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，木犀草苷、毛蕊花糖苷、槲皮素、木犀草素、蘆丁峰面積的RSD分別為1.6%、2.1%、1.4%、1.2%、1.5%（n＝8），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（批號(hào)：20160101）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，木犀草苷、毛蕊花糖苷、槲皮素、木犀草素、蘆丁含量的平均值分別為2.41、21.37、1.41、1.95、1.64 mg/g，RSD分別為0.9%、2.2%、1.1%、1.4%、1.2%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（批號(hào)：20160101）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

2.9 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 4 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

采用UPLC-MS/MS技術(shù)測定中藥中多種有效成分的含量，在試驗(yàn)操作過程、分析時(shí)間、方法專屬性和檢測靈敏度等方面均優(yōu)于高效液相色譜法，可有效地提高檢測效率[6]。筆者查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前尚未見采用UPLCM/MS法同時(shí)測定裸花紫珠干浸膏中多種有效成分含量的報(bào)道。

筆者在試驗(yàn)過程中，在干燥氣溫度、干燥氣流量、霧化器壓力、鞘流氣溫度、鞘流氣流量、碎裂電壓、碰撞能量、電離模式等方面對(duì)質(zhì)譜檢測參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化[7-8]。同時(shí)，通過變換色譜柱品牌、型號(hào)，流動(dòng)相種類、比例、流速以及梯度洗脫程序等優(yōu)化了色譜分離的條件。

綜上所述，本方法簡單、快速、準(zhǔn)確度及靈敏度高、專屬性好，可用于裸花紫珠干浸膏和裸花紫珠制劑的質(zhì)量控制，同時(shí)亦為裸花紫珠中藥材的開發(fā)提供了質(zhì)量控制的技術(shù)方法和依據(jù)。

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（編輯：張 靜）

Simultaneous Determination of 5 Effective Components in Luohua Zizhu Dry Extract by UPLC-MS/MS

ZHENG Pei，TANG Bingli，LIN Yanzhu，F(xiàn)ENG Chunyan，XING Zhengyu（Haikou Branch，Hainan Institute for Food and Drug Control，Haikou 570216，China）

R927

A

1001-0408（2017）21-2997-03

2016-11-11

2017-01-13）

＊主管藥師。研究方向：藥品檢驗(yàn)。E-mail：12123089@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.21.33