何清英 羅志華 林棉杰 陳俊杰 鄧秋怡 溫斌 陳珺

摘要 [目的]探討電刺激對鐵皮石斛原球莖中石斛堿含量的影響。[方法]采用鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖，并將擴增所得原球莖隨機分為試驗組和對照組，其中試驗組給予不同時間電刺激（25 V），對照組不做處理，正常培養(yǎng)15 d后，以氯仿熱回流法提取原球莖中的石斛堿，紫外分光光度法測定石斛堿含量。[結(jié)果]與對照組相比，經(jīng)電刺激（25 V）1 和2 h的試驗組鐵皮石斛原球莖石斛堿含量顯著增加（P<0.05），而經(jīng)電刺激（25 V）3 h的試驗組鐵皮石斛原球莖石斛堿含量下降（P<0.05）。[結(jié)論]25 V電刺激1、2 h能夠促進(jìn)鐵皮石斛原球莖中的石斛堿積累，這可能與電刺激能改變原球莖中細(xì)胞的滲透性、增強對培養(yǎng)基中各種成分的吸收，導(dǎo)致內(nèi)源次生代謝物增加有關(guān)。

關(guān)鍵詞 鐵皮石斛；原球莖；電刺激；石斛堿；紫外分光光度法

中圖分類號 S567.23+9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）07-0114-02

Effects of Electrostimulation on Dendrobine Content in Protocorm of Dendrobium officinale

HE Qing-ying， LUO Zhi-hua， LIN Mian-jie， CHEN Jun* et al

（School of Biosciences and Biopharmaceutics， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou， Guangdong 510006）

Abstract [Objective] To investigate the effects of electrostimulation on dendrobine content in protocorm of Dendrobium officinale. [Method] Protocorms were cultured by protocorm culture medium and randomly divided into two groups， the experimental group was treated with electrostimulation（25 V） while the control group did not be disposed. After 15 days incubation， dendrobine was extracted by chloroform and hot-refluxing， and determinated by ultraviolet spectrophotometry. [Result] Compared with the control group， the dendrobine content of experimental group treated with electrostimulation（25 V） for 1 h or 2 h was increased significantly（P<0.05）， while the dendrobine content was decreased（P<0.05） in experimental group treated by electrostimulation（25 V） for 3 h. [Conclusion] The electrostimulation（25 V） for 1 h or 2 h can promote the accumulation of dendrobine in protocorm， and the mechanism may be related to the changed permeability of cell， the enhanced absorption of nutrients and the increased endogenous secondary metabolites.

Key words Dendrobium officinale；Protocorm；Electrostimulation；Dendrobine；Ultraviolet spectrophotometry

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，具有滋陰、益胃、生津止渴、潤肺止咳、強壯及增強免疫活性的作用。石斛堿作為鐵皮石斛藥用成分之一，具有抗腫瘤、抗衰老等作用[1-2]，但鐵皮石斛中石斛堿的含量相對較少[3]，因此，通過探尋合適的方法來提高石斛堿含量具有重要的意義。

近年來，電刺激對植物生長的影響研究就一直受到關(guān)注[4-6]，潘學(xué)武等[7]研究發(fā)現(xiàn)微交流電刺激可使紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的紫杉醇含量提高3倍多，而脈沖電刺激處理組則提高了7～9倍。為了探究電刺激法是否可以運用于提高鐵皮石斛原球莖的石斛堿含量，該研究通過使用25 V交流電對鐵皮石斛原球莖進(jìn)行不同時間段的刺激，并且培養(yǎng)15 d后，檢測其石斛堿含量。

1 材料與方法

1.1 試材

鐵皮石斛原球莖，購自澄思源生物科技（上海）有限公司，經(jīng)鑒定為天目山鐵皮石斛原球莖。鐵皮石斛石斛堿標(biāo)準(zhǔn)品（MUST-12080608），純度99.99%，購自廣州市藥檢所；溴甲酚綠（天津市大茂化學(xué)試劑廠，20130510）。

1.2 主要儀器設(shè)備

電刺激儀—交流變壓器（上海征西電氣科技有限公司，BK-200VA型），分析天平（中韓合資科威電子儀器有限公司，AK-1200型），紫外可見光分光光度計[尤尼柯（上海）儀器有限公司，WFZ UV-2000型]。

1.3 試驗方法

1.3.1

鐵皮石斛原球莖的擴增培養(yǎng)。參考前人研究的原球莖的增殖擴增培養(yǎng)方案[8-10]，結(jié)合以往經(jīng)驗，設(shè)計了9種不同的MS培養(yǎng)基（表1），分別進(jìn)行原球莖擴增培養(yǎng)，得出最佳擴增培養(yǎng)基配方，此配方也用于后續(xù)電刺激試驗后的繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。參照徐寧[11]的方法，精稱石斛堿對照品5 mg，置50.0 mL容量瓶，加氯仿定容至刻度，配成100 mg/L的石斛堿氯仿溶液，分別在6個10 mL容量瓶中加入石斛堿氯仿溶液0、1、2、3、4、5 mL，用氯仿定容至10 mL，將容量瓶中的溶液移至分液漏斗中，再加入pH緩沖液5.0 mL和1.0 mL 0.04%溴甲酚綠溶液，劇烈振搖3 min，靜置30 min，將氯仿層通過藥棉（事先已浸泡過氯仿并干燥）過濾，取續(xù)濾液5.0 mL，再加入0.01 mol/L氫氧化鈉無水乙醇溶液1.0 mL，充分搖勻，于波長620 nm處測定吸光度，以所測得的吸光度為縱坐標(biāo)、對應(yīng)的石斛堿濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3

電刺激試驗與原球莖樣品制備。

1.3.3.1

鐵皮石斛原球莖的電刺激試驗。選取同一批次擴增培養(yǎng)的鐵皮石斛原球莖，隨機均分等量平行進(jìn)行3次試驗，隨機分為6組：1 h試驗組與1 h對照組、2 h試驗組與2 h對照組、3 h試驗組與3 h對照組。試驗組分別進(jìn)行1、2、3 h電刺激處理，電刺激強度均為25 V；對照組不做電刺激處理，其余條件與試驗組保持一致。將各組原球莖均接種至固體培養(yǎng)基中擴增培養(yǎng)15 d。

1.3.3.2

檢測石斛堿含量。經(jīng)擴增培養(yǎng)15 d后，取出各組原球莖，置于95～110 ℃溫度下殺青0.5 h，60 ℃條件下干燥過夜，經(jīng)研磨成粉，過60目篩備用。參照徐寧[11]的方法，稱取樣品粉末并記錄重量。再用5 mL氨水浸濕樣品30 min（保持密封狀態(tài)），精密量取加入10.0 mL氯仿，并且稱重記錄。水浴回流加熱2 h，冷卻后稱重，用氯仿補充至原重，搖勻，過濾，接收續(xù)濾液，并記錄體積。精密量取3 mL續(xù)濾液并定容至10 mL容量瓶，按“1.3.2”方法，加入緩沖液和溴甲酚綠溶液，顯色后，于波長620 nm處測其吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有參數(shù)均用x±S表示，用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，LSD- t檢驗法比較組間的變量差異，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛原球莖的擴增培養(yǎng)基配方

多次試驗發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛原球莖在配方②MS固體培養(yǎng)基中（含2.0 mg/L 6-BA、1.0 mg/L NAA、3%蔗糖、0.7%瓊脂）顏色翠綠、疏松，生長狀態(tài)好，說明該配方適合原球莖擴增。因此，后續(xù)試驗中均以此配方進(jìn)行原球莖培養(yǎng)。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1

線性關(guān)系。按“1.3.2”方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，重復(fù)試驗5次，以石斛堿濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得出石斛堿的線性回歸方程為y=0.006 7x+0.004 2（r=0.999 6），表明石斛堿濃度在1～5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，適用于計算樣品中石斛堿含量。

2.2.2

顯色穩(wěn)定性試驗。以石斛堿標(biāo)準(zhǔn)品制備供試品溶液（3.0 μg/mL），按線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法操作，加入氫氧化鈉無水乙醇溶液后，在0、15、30、60和120 min時分別測定溶液吸光度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入氫氧化鈉無水乙醇30 min內(nèi)顯色穩(wěn)定，超過30 min后變動較大，故需及時測定。這與李亞芳等[12]的研究結(jié)果一致。氫氧化鈉的無水乙醇溶液主要是通過調(diào)整溶液pH而影響顯色，因無水乙醇揮發(fā)性很強，要求加入氫氧化鈉、無水乙醇溶液充分振蕩混勻后即時測定，同批次試驗時要安排好不同樣品的測定順序，確保顯色反應(yīng)時間一致。

2.2.3

精密度、重復(fù)性試驗。以石斛堿標(biāo)準(zhǔn)品制備供試品溶液（3.0 μg/mL），分別進(jìn)行精密度試驗（取同一批供試品溶液連續(xù)測定5次）和重復(fù)性（取同一批供試品平行制備5份供試品溶液，分別測定）試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精密度試驗中RSD為1.72%，表明該方法精密度良好；重復(fù)性試驗中RSD為2.55%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4

回收率試驗。取過60目篩后的鐵皮石斛原球莖樣品粉末，稱重并從中分取2份各0.3 g，其中1份樣品粉末按“1.3.3.2”方法制備成待測樣品溶液并進(jìn)行含量測定，測得吸光度并計算石斛堿含量M1；取另一份樣品粉末，加入與M1質(zhì)量相當(dāng)?shù)氖鷫A標(biāo)準(zhǔn)品Ms，按“1.3.3.2”方法制備待測樣品溶液并進(jìn)行含量測定，測得吸光度并計算石斛堿含量M2，平行測定5組樣品，計算回收率。由表2可見，平均回收率為109.33%，RSD為2.82%，表明該方法可行，且回收率較好。

2.3 電刺激對生物堿含量的影響

試驗結(jié)果表明，試驗組1（電刺激1 h）和試驗組2（電刺激2 h）鐵皮石斛原球莖的石斛堿含量均明顯高于對照組（P<0.05）；而試驗組3（電刺激3 h）的石斛堿含量顯著低于對照組（P<0.05）。

3 討論

辛明等[13]分析發(fā)現(xiàn)，不同干燥工藝（熱風(fēng)干燥、真空干燥、真空冷凍干燥、自然晾干）對石斛堿含量無影響，認(rèn)為生物堿在石斛植物衰老死亡過程中其總量是不變的，因此電刺激后的石斛堿經(jīng)高溫殺青后采取熱風(fēng)干燥以保證時間效率。徐寧[11]、李亞芳等[12]的氯仿熱提取方案能夠有效提取出石斛堿，且經(jīng)提取2、3 h的石斛堿含量無顯著性差異，因此該試驗采用2 h氯仿熱回流提取樣品中的石斛堿。

近幾年來，國內(nèi)外許多學(xué)者通過外加恒壓或恒流的方式展開電刺激對植物生長影響的探究，即對植物外加高壓靜電場進(jìn)行刺激或通過外加衡電流進(jìn)行刺激。細(xì)胞在一定的刺激條件下，膜電位會發(fā)生瞬時變化，從而產(chǎn)生動作電位會對細(xì)胞的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。從20世紀(jì)80年代開始就有學(xué)者探究電刺激對植物愈傷組織的影響[5-6，14-15]，如Rathore等[15]研究發(fā)現(xiàn)對煙草愈傷組織進(jìn)行1×10-6A的電流刺激后，可以提高70%的生長速率。戴群等[4]分析發(fā)現(xiàn)小麥原生質(zhì)體經(jīng)微直流電刺激后對細(xì)胞團(tuán)的形成有促進(jìn)作用。潘學(xué)武等[7]研究發(fā)現(xiàn)脈沖電刺激可有效提高紫杉醇的胞外釋放率，達(dá)對照組的4～5倍。而該試驗結(jié)果表明，25 V電刺激1、2 h對鐵皮石斛原球莖中有效成分石斛堿的含量有顯著的促進(jìn)作用（P<0.05），但電刺激3 h（25 V）對鐵皮石斛原球莖中有效成分石斛堿的含量有顯著的抑制作用（P<0.05）。趙劍等[6]認(rèn)為外加電壓影響了細(xì)胞的代謝以及多種酶活，初步分析同一電壓不同時長下會產(chǎn)生不同的結(jié)果是因為在一定時間內(nèi)電刺激影響了ATP的合成，增加了酶活，從而促進(jìn)了原球莖中石斛堿含量的產(chǎn)生；超過一定時間后由于電極的發(fā)熱導(dǎo)致溫度上升，影響細(xì)胞代謝，降低酶活，導(dǎo)致原球莖中石斛堿含量的降低。表明電刺激法可以提高鐵皮石斛原球莖中石斛堿含量。

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