劉建花，齊曉琴，李金鵬，張惠玲

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021）

干化葡萄酒釀造中不同干化處理對白藜蘆醇的影響

劉建花，齊曉琴，李金鵬，張惠玲*

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川750021）

研究以寧夏賀蘭山東麓赤霞珠葡萄為原料釀制干化葡萄酒時(shí)3種不同干化處理方法（日光下曬制、日光下隔離紫外線曬制、陰制）對葡萄及葡萄酒中白藜蘆醇含量的影響，以及干化處理時(shí)天氣的溫度、紫外線強(qiáng)度及葡萄水分損失對白藜蘆醇含量的影響。采用高相液相色譜法（HPLC）測定葡萄及葡萄酒中白藜蘆醇的含量。結(jié)果表明：以未處理的鮮葡萄做對照，3種干化方法都可以提高葡萄以及用它們釀制的葡萄酒中白藜蘆醇的含量。相比未處理的鮮葡萄，3種干化方法使葡萄中的白藜蘆醇含量分別提高了206.17%、187.65%、138.27%，所釀制的干化葡萄酒中白藜蘆醇含量分別提高了139.46%、116.22%、75.30%，干化過程中溫度對白藜蘆醇含量影響較大，日光下紫外線及葡萄水分含量對白藜蘆醇含量影響較小。

曬制；陰制；干化酒；白藜蘆醇

近年來，葡萄酒中白藜蘆醇有益于人體健康方面的研究一直是研究者們的熱點(diǎn)，特別是在軟化血管方面具有很好的功效，長期適量飲用紅葡萄酒能夠降低出現(xiàn)心血管疾病的危險(xiǎn)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有多種生物學(xué)作用[2]，可抑制血小板聚集和低密度脂蛋白氧化，調(diào)節(jié)脂蛋白代謝從而降低人體血脂，防止血栓形成。但是，自然條件下的葡萄以及葡萄酒中白藜蘆醇含量很低，只有在遭受病蟲害、機(jī)械傷害的情況下，葡萄才能大量合成白藜蘆醇。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，采收后的某些植物在紫外照射、霉變等情況下也可誘導(dǎo)組織繼續(xù)產(chǎn)生白藜蘆醇[3]，干化葡萄酒在釀酒前需要對葡萄進(jìn)行曬制或陰制，使水分降低糖度達(dá)到30%～35%再進(jìn)行釀制，在此期間葡萄會(huì)受到溫度、日光紫外線以及水分脫失的外界影響，這些因素可能會(huì)刺激白藜蘆醇合成，目前在此方面還少見報(bào)道。

本文研究干化葡萄酒釀造中3種不同干化方法對采后的葡萄及釀制的葡萄酒中白藜蘆醇含量的影響，目的獲得有利于提高白藜蘆醇含量的處理工藝，為釀造富含白藜蘆醇的優(yōu)質(zhì)干紅葡萄酒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

赤霞珠葡萄：采自寧夏蒲尚酒莊2015年份新鮮葡萄；有機(jī)玻璃：上海美佳塑料制品有限公司。

1.2 主要儀器

SCL-10AVP高效液相色譜：島津儀器公司；RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DirectQ3 UV超純水機(jī)：MILLIPORE公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；ZQJ-254型紫外線強(qiáng)度檢測儀（測量波長范圍200 nm～320 nm）：上海寶山電光儀器廠；101B-2型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；梅特勒電子天平：托利多儀器（上海）有限公司；DP-1007DG冷凍干燥機(jī)：無錫德譜儀器制造有限公司；LTI-700恒溫培養(yǎng)箱：北京中儀友信科技有限公司。

1.3 主要試劑

乙酸乙酯（分析純）、甲醇（色譜純）、色譜純（乙腈）、白藜蘆醇標(biāo)樣（純度為99.95%）：寧夏盛泰爾生物有限公司。

1.4 干化葡萄的晾制試驗(yàn)過程

1.4.1 曬制

1.4.1.1 日光下曬制

將采摘的新鮮赤霞珠葡萄每筐平鋪一層放置，采摘與放置過程中盡量防止葡萄碰破，之后在日光下照射，保證日出到日落期間都能夠照射到陽光。試驗(yàn)過程中選取溫差較大和紫外線強(qiáng)度最強(qiáng)時(shí)取樣，共取7次樣、樣品編號(hào)1～7，每天檢測環(huán)境溫度與紫外線強(qiáng)度、葡萄水分含量及含糖量，記錄天氣狀況，當(dāng)葡萄糖度達(dá)到30%～35%時(shí)，停止曬制。

1.4.1.2 日光下隔離紫外線曬制

將采摘的新鮮赤霞珠葡萄每筐平鋪一層放置，筐的上部搭置兩層有機(jī)玻璃用來隔離紫外線，與日光下曬制的葡萄在同一場地，相同的時(shí)間段以及相同的天氣狀況下曬制，取樣方法及樣品編號(hào)同日光下曬制相同，每天檢測環(huán)境溫度、葡萄的水分含量以及含糖量，記錄天氣狀況，當(dāng)葡萄糖度達(dá)到30%～35%時(shí)，停止曬制。

1.4.2 陰制

將采摘的新鮮赤霞珠葡萄每筐平鋪一層（或者將葡萄懸掛起來）放置在較偏涼避光的房間內(nèi)，避免太陽光的照射，擺放盡量稀疏，防止長霉。取樣方法及樣品編號(hào)同日光下曬制相同，每天檢測環(huán)境溫度、葡萄的水分含量以及含糖量，記錄天氣狀況，當(dāng)葡萄糖度達(dá)到30%～35%時(shí)，停止陰制。

1.4.3 模擬試驗(yàn)

為了更好的分析外界環(huán)境對白藜蘆醇的影響，進(jìn)行以下模擬試驗(yàn)：

1）溫度：以一天的早晨、中午、下午、晚上4個(gè)階段的溫度為參數(shù)，分別設(shè)置溫度為16、22、17、10℃，每個(gè)溫度條件下放置5 h之后取樣、測定白藜蘆醇含量。

2）紫外線：取曬制過程中的紫外線強(qiáng)度5.11、6.16、7.43 μW/cm2，作為模擬參數(shù)，分別在該強(qiáng)度紫外線下照射5 h之后，取樣、測定白藜蘆醇含量。

3）水分：將新鮮葡萄放置在冷凍干燥箱內(nèi)，使葡萄的水分含量分別減少到晾制時(shí)所取樣品對應(yīng)的不同階段的水分，即83.23%、74.19%、63.26%，取樣、測定白藜蘆醇含量。

1.5 干化葡萄酒的釀造

用3種不同干化方法處理獲得的干化赤霞珠葡萄分別進(jìn)行葡萄酒釀制，并以同批新鮮赤霞珠葡萄進(jìn)行釀造作對比，在釀造過程中定時(shí)取樣，測定樣品中白藜蘆醇的含量。

1.6 檢測方法

1.6.1 水分含量的測定

將各葡萄樣品分別置于烘干并已知質(zhì)量m的稱量瓶中，稱鮮重m1。提前將干燥箱溫度升至105℃，將稱過鮮重的樣品連同稱量瓶放入干燥箱中，將稱量瓶開蓋放置，烘至恒重。取出稱量瓶，放干燥器中冷卻至室溫，稱重m2。通過稱量葡萄干重和鮮重計(jì)算葡萄中的水分含量，每個(gè)樣品重復(fù)3次[4]。計(jì)算公式：

葡萄組織含水量/%=[（m1-m2）/（m1-m）]×100

式中：m1為鮮重，g；m2為干重，g；m為稱量瓶的重量，g。

1.6.2 紫外線的測定

使用ZQJ-254型紫外線強(qiáng)度檢測儀（測量波長范圍200 nm～320 nm）進(jìn)行檢測。

1.6.3 白藜蘆醇的測定

使用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行測量。

1.6.3.1 樣品中白藜蘆醇的提取

準(zhǔn)確稱取20 g樣品置于勻漿機(jī)內(nèi)搗碎，加乙酸乙酯定容至50 mL，超聲波輔助提取30 min后，置于4℃冰箱中，浸提48 h后，用砂心漏斗過濾，濾液在40℃條件下減壓濃縮，將粗提物加入甲醇定容至5 mL，將上述樣品經(jīng)0.45 μm脂溶性微孔濾膜過濾，在高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測。

1.6.3.2 色譜條件

結(jié)合參考文獻(xiàn)與實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有工作基礎(chǔ)，稍加改進(jìn)，確定色譜條件：色譜柱為反相色譜柱Eclipse XDB C-18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)40%的乙腈水溶液，流速為1.0 mL/min；檢測波長306 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為20 μL。

1.6.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取一定量的白藜蘆醇標(biāo)樣，分別用流動(dòng)相配制成40、20、10、2.5 mg/L 4個(gè)不同濃度的溶液，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾上機(jī)測定。以濃度為X軸，峰面積為Y軸，建立線性回歸方程。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)過程中的天氣狀況

試驗(yàn)過程中每隔5天取樣，共取7次樣，樣品編號(hào)1～7，對應(yīng)的天氣狀況見表1，葡萄陰制過程中室內(nèi)溫度狀況見表2。

表1 葡萄曬制過程中的天氣狀況Table 1 Grapes Weather proofing process

表2 葡萄陰制過程中室內(nèi)溫度狀況Table 2 Grape room temperature refining process condition

圖1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Resveratrol standard curve

2.2 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取一定量的白藜蘆醇標(biāo)樣，分別用流動(dòng)相配制成40、20、10、2.5 mg/L 4個(gè)不同濃度的溶液，每次進(jìn)樣20 μL，以白藜蘆醇含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）。

2.3 3種干化過程中各參數(shù)與葡萄中白藜蘆醇含量

干化過程中各參數(shù)與葡萄中白藜蘆醇含量見表3。由表3可以看出，在3種干化方法下，隨著晾制時(shí)間的增加，葡萄中的水分不斷下降，糖度不斷增大，白藜蘆醇的含量也隨之增加，但溫度、紫外線強(qiáng)度、葡萄水分下降哪一個(gè)對白藜蘆醇含量影響較大，需要下面的模擬試驗(yàn)進(jìn)一步確定。

表3 干化過程中各參數(shù)與葡萄中白藜蘆醇含量Table 3 Drying process parameters and resveratrol content in grapes

續(xù)表3 干化過程中各參數(shù)與葡萄中白藜蘆醇含量Continue table 3 Drying process parameters and resveratrol content in grapes

2.4 模擬試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 溫度對白藜蘆醇含量的影響

溫度對白藜蘆醇含量的影響見圖2。

圖2 溫度對白藜蘆醇含量的影響Fig.2 Effect of temperature on the content of resveratrol

由圖2可以看出，溫度對葡萄中白藜蘆醇含量影響較大，處理后葡萄中白藜蘆醇含量分別為22℃＞17℃＞16℃＞10℃，最高可以達(dá)到1.45 mg/L，相比鮮葡萄中白藜蘆醇含量（0.81 mg/L）提高了80%。這是因?yàn)閱?dòng)白藜蘆醇合成的二苯乙烯合酶（Stilbene Synthase，簡稱STS）的合成受誘導(dǎo)型基因表達(dá)調(diào)控[5]，在正常情況下STS合成途徑是關(guān)閉的，只有當(dāng)受到逆境脅迫誘導(dǎo)后，STS酶激活，才啟動(dòng)白藜蘆醇的合成[6-7]，當(dāng)溫度升高時(shí)，STS酶活性增強(qiáng)，加快了白藜蘆醇的合成。另一方面，可能是因?yàn)槠咸阎泻幸幌盗幸园邹继J醇為基本單位在植物體內(nèi)脫氫聚合生成的白藜蘆醇衍生物，這些衍生物具有與白藜蘆醇相似的生物活性，其中有些化合物的活性、選擇性和穩(wěn)定性甚至強(qiáng)于白藜蘆醇，這些多聚體通過調(diào)整溫度可以轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇[8]。

2.4.2 紫外線對白藜蘆醇含量的影響

紫外線對白藜蘆醇含量的影響見圖3。

圖3 紫外線對白藜蘆醇含量的影響Fig.3 Effect of UV on the content of resveratrol

由圖3可以看出，模擬試驗(yàn)中，葡萄中白藜蘆醇的含量受紫外線的影響較小，鮮葡萄在紫外線強(qiáng)度為（7.43±0.41）μW/cm2下照射5 h后葡萄中白藜蘆醇含量最高達(dá)到0.92 mg/L，相比鮮葡萄中白藜蘆醇含量（0.81 mg/L）提高了13%。這是因?yàn)閱?dòng)白藜蘆醇合成所需的STS酶對紫外線的感受區(qū)在260 nm～270 nm[9]，在300 nm以上時(shí)，只有少量甚至無白藜蘆醇產(chǎn)生，而正常的日光中恰恰缺乏300 nm以下的紫外線[10]，葡萄雖然暴露在日光中，但是缺少啟動(dòng)誘導(dǎo)型基因表達(dá)的“外力”而無法大量合成白藜蘆醇。2.4.3 水分對白藜蘆醇含量的影響

水分對白藜蘆醇含量的影響見圖4。

由圖4可以看出，水分變化對葡萄中白藜蘆醇含量影響較小，鮮葡萄水分減少到56.26%時(shí)，葡萄中白藜蘆醇含量增加到0.87 mg/L，相比鮮葡萄中白藜蘆醇含量（0.81 mg/L）提高了7%。這可能是因?yàn)閱?dòng)白藜蘆醇合成的STS酶對水分不敏感，葡萄水分含量下降不能激活STS酶的活性，僅僅是因?yàn)槠咸阉纸档桶邹继J醇因?yàn)楦晌镔|(zhì)的濃縮含量隨之稍有增加，還有待進(jìn)一步研究。

圖4 水分對白藜蘆醇含量的影響Fig.4 Effect of moisture on the content of resveratrol

2.5 不同釀制方法葡萄酒中白藜蘆醇含量比較

不同釀制方法葡萄酒中白藜蘆醇含量比較見圖5。

圖5 不同釀制方法葡萄酒中白藜蘆醇含量比較Fig.5 Comparison of the content of resveratrol in different wine-growing methods

由圖5可知，鮮葡萄、日光下曬制、日光下隔離紫外線曬制、陰制葡萄原料的初期白藜蘆醇含量是鮮葡萄＜陰制葡萄＜日光下隔離紫外線曬制葡萄＜日光下曬制葡萄，在主發(fā)酵結(jié)束時(shí)都有所增加，其中，鮮葡萄酒、陰制干化酒、日光下隔離紫外線曬制干化酒、日光下曬制干化酒的白藜蘆醇含量分別達(dá)到4.13、7.24、8.93、9.89 mg/L，后發(fā)酵階段白藜蘆醇含量稍有減少并趨于平穩(wěn)。這是因?yàn)楫?dāng)添加果膠酶和酵母進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，在酶解作用下，使白藜蘆醇及其衍生物的單體釋放出來，進(jìn)而被發(fā)酵所生成的酒精反復(fù)萃取進(jìn)入葡萄酒中，隨著酒精生成量的增加，它們的含量也增加；當(dāng)主發(fā)酵完成除去皮渣后進(jìn)入蘋果酸-乳酸發(fā)酵，由于輕度氧化的作用，使得白藜蘆醇及其衍生物的含量略有下降[11]。

3 結(jié)論

1）日光下曬制、日光下隔離紫外線曬制、陰制處理3種干化處理后的葡萄中白藜蘆醇含量都有所提高，最高可提高206.17%。

2）通過模擬試驗(yàn)，分析了單因素溫度、紫外線強(qiáng)度、葡萄水分下降對葡萄中白藜蘆醇影響，結(jié)果得出，鮮葡萄在紫外線強(qiáng)度為（7.43±0.41）μW/cm2下照射5 h后葡萄中白藜蘆醇含量提高了13%，鮮葡萄水分減少到56.26%時(shí)，葡萄中白藜蘆醇的含量提高了7%。鮮葡萄在22℃下放置5 h葡萄中白藜蘆醇含量可以提高80%，說明了溫度對白藜蘆醇含量影響較大，紫外線及葡萄水分下降對白藜蘆醇含量影響相比而言小一些，這是由于溫度可以促進(jìn)提高合成白藜蘆醇所需的STS酶的活性；紫外線和水分是間接環(huán)境刺激脅迫所導(dǎo)致白藜蘆醇合成。

3）用干化處理后的葡萄所釀造的葡萄酒，明顯比鮮葡萄釀制的葡萄酒白藜蘆醇含量高，由于干化處理后的葡萄中的白藜蘆醇較高，并在發(fā)酵過程中由于葡萄的破碎與酶的水解釋放使發(fā)酵過程中白藜蘆醇含量持續(xù)升高，到發(fā)酵結(jié)束時(shí)白藜蘆醇含量比鮮葡萄酒中白藜蘆醇含量提高了75.30%～139.46%。

[1]Renaud S,Logeril M D.Wine,alcohol,platelets,and french paradox for coronary heart disease[J].Lancet,1992,339：1523-1526

[2]Jeandet P,Bessis R,Sbaghi M,et al.Production of the phytoalexin resveratrol by grape as response to Botrytis attack under natural conditions[J].Journal of Phytopathology-phytopathologische Zeitschrift, 1995,143：135-139

[3]李華.現(xiàn)代葡萄酒工藝學(xué)[M].西安：陜西人民出版社,2000：56-61 [4]曹健康,姜微波,趙玉梅.果蔬采后生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社,2007：113-118

[5]Lanz T,Tropf S,Marner F J,et al.The role of cysteines in polyketide synthases[J].J Biological Chemistry 1991,15：9971-9976

[8]李景明.葡萄采后白蔡蘆醇的誘導(dǎo)與葡萄酒中白葵蘆醇的調(diào)控研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2003：19-24

[9]Langcake P,Pryce R J.The production of resveratrol and the viiferins by grapevines in response toultraviolet irradiaion[J].Phytochemistry,1977,16：1193-1196

[10]Gates D M.Spectral distribution of solar radiation at the earth's surface[J].Science,1966,151：523-529

[11]高年發(fā),陳志頔,姜麗,等.葡萄酒發(fā)酵過程中白藜蘆醇含量變化的研究[J].釀酒科技,2006(12)：13-15

The Effects of Different Desiccated Method on Resveratrol Content during the Process of Desiccation

LIU Jian-hua，QI Xiao-qin，LI Jin-peng，ZHANG Hui-ling*
（College of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021，Ningxia，China）

This experiment had studied the impact of three different methods of desiccating on grapes and wine resveratrol content as well as the influence temperature，ultraviolet ray and grape moisture have on resveratrol content during the process of desiccation.It had adopted HPLC to test the resveratrol content in grape and wine made from grapes.However，it turned out that all three desiccation methods could help to improve the resveratrol content in grape and wine made from grapes.Compared with unprocessed fresh grapes，all three desiccation methodshadrespectivelyhelpedtheresveratrolcontentingrapetoincreaseby206.17%，187.65%and138.27%，and that in wine made from grapes to respectively rise by 139.46%，116.22%and 75.30%.During the process，temperature had a great influence on the resveratrol content while ultraviolet ray and grape moisture have little impact on the resveratrol content.

basking under sunshine；shady production conditions；desiccated wine；resveratrol

2016-09-05

寧夏回族自治區(qū)科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目

劉建花（1990—），女（漢），碩士研究生，研究方向：微生物發(fā)酵。

*通信作者

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.022