劉寬，蘇佳，楊韻渲，張璐，何慶峰

（天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384）

半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白酶法提取工藝研究

劉寬，蘇佳，楊韻渲，張璐，何慶峰*

（天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384）

半滑舌鰨在沿海地區(qū)被廣泛養(yǎng)殖及食用，其魚(yú)皮可能成為制備食品膠原的良好材料來(lái)源。本研究以膠原得率為指標(biāo)，考察了酶提法提取魚(yú)皮膠原的影響因素（蛋白酶添加量，酶提取時(shí)間，酶提取溫度），并采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了最優(yōu)提取工藝。結(jié)果表明，魚(yú)皮膠原蛋白得率最優(yōu)提取條件為：酶添加量為1.06%，提取溫度為4℃，提取時(shí)間為19.5 h。在此條件下，魚(yú)皮膠原提取率為42.1%。進(jìn)一步的營(yíng)養(yǎng)分析發(fā)現(xiàn)，提取的魚(yú)皮膠原中粗蛋白含量為89.76%，灰分含量為1.37%，脂肪含量0.81%，水分7.52%。

半滑舌鰨；膠原；魚(yú)皮；響應(yīng)面設(shè)計(jì)

膠原蛋白廣泛的存在于動(dòng)物的皮膚、骨骼、結(jié)蹄組織，被廣泛的應(yīng)用于攝影，化妝品，生物材料及醫(yī)藥等行業(yè)[1]。此外，由于膠原蛋白能增強(qiáng)食品材料的黏度，彈性及穩(wěn)定性，其又被廣泛應(yīng)用食品行業(yè)，如食品封裝，膠囊的制作及可食膠原的生產(chǎn)。目前，商業(yè)膠原蛋白的生產(chǎn)主要是以牛、豬的皮膚、骨、結(jié)締組織為原料，而瘋牛病及手足口病等食品安全問(wèn)題的爆發(fā)，以及宗教問(wèn)題迫使人們開(kāi)發(fā)新的膠原蛋白生產(chǎn)原料。魚(yú)皮是魚(yú)產(chǎn)品加工企業(yè)常見(jiàn)的下腳料，若被丟棄會(huì)造成極大的浪費(fèi)及環(huán)境污染[2]。因此，魚(yú)皮膠原蛋白的提取研究一直是食品行業(yè)的研究熱點(diǎn)之一，國(guó)內(nèi)外已有較多關(guān)于魚(yú)皮膠原的報(bào)道[3-4]，但魚(yú)皮膠原蛋白提取效率及特性受提取方法及魚(yú)皮來(lái)源的影響較大[5-6]。

半滑舌鰨屬鰈形目、舌鰨科、舌鰨屬，俗稱“龍脷”、牛舌頭、鰨目，是一種暖溫性近海大型底層魚(yú)類(lèi)。其肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，在渤海地區(qū)尤其是天津地區(qū)被廣泛養(yǎng)殖和食用，深受人們喜愛(ài)。半滑舌鰨一般被去皮加工冷凍成魚(yú)段、魚(yú)排出售，而大量的魚(yú)皮下腳料是加工膠原蛋白的良好原料。此外，大量研究表明，暖溫性海水魚(yú)的膠原特點(diǎn)及亞氨基酸（脯氨酸及羥脯氨酸）含量?jī)?yōu)于冷水魚(yú)[7-8]。因此，半滑舌鰨魚(yú)皮應(yīng)該是制備膠原蛋白的良好原料。但到目前為止，還沒(méi)有關(guān)于半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白提取工藝的相關(guān)報(bào)道。本研究以天津地區(qū)養(yǎng)殖的半滑舌鰨魚(yú)皮為原料，研究了其膠原蛋白的酶法提取工藝，為半滑舌鰨魚(yú)皮的有效利用和商業(yè)開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

半滑舌鰨魚(yú)皮：天津紅旗水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)；胃蛋白酶（10 000 IU/g）：天津明川生物試劑公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

SHZ-82恒溫震蕩器：金壇市萬(wàn)華實(shí)驗(yàn)儀器廠；BCD-256KFB恒溫冰箱：青島海爾有限公司；YB-FD-1真空冷凍干燥機(jī)：上海億倍實(shí)業(yè)有限公司；KQ-500DE超聲清洗器：昆山舒美超聲儀器有限公司；EX224型電子天平：OHAUS/奧豪斯儀器（上海）有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 半滑舌鰨魚(yú)皮膠原提取工藝流程

具體工藝流程參考文獻(xiàn)[9]。

1.3.1 魚(yú)皮預(yù)處理

新鮮半滑舌鰨魚(yú)取皮洗凈晾干，自來(lái)水洗滌3次并切成小塊（1 cm3），真空包裝并儲(chǔ)存在-20℃直至進(jìn)一步使用。

1.3.2 脫色、除雜蛋白

以含1%H2O2，3%NaCl及0.1 mol/L NaOH溶液處理魚(yú)皮6 h，離心，除去廢液，得碎魚(yú)皮。

1.3.3 除脂

將脫色除雜蛋白后的碎魚(yú)皮用去離子水洗至中性，加入乙醚/異丙醇/蒸餾水（2∶2∶8，體積比）浸泡12 h，去除脂肪。

1.3.4 酶解

以膠原蛋白得率為指標(biāo)，在pH2.0～3.0條件下，以胃蛋白酶進(jìn)行膠原蛋白提取，對(duì)加酶量（加酶量/魚(yú)皮重量）、酶解溫度、酶解時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最優(yōu)酶提條件。酶解液過(guò)濾，8 000 r/min低溫離心20 min，取上清液。

1.3.5 鹽析

將酶解液離心后取上清液，pH調(diào)至中性，邊攪拌邊緩慢加入（NH4）2SO4，至其濃度達(dá)到1.5 mol/L，10 min內(nèi)完全溶解，靜置10 h～12 h。然后低溫離心，收集沉淀。

1.3.6 透析

將沉淀用0.5 mol/L的醋酸洗脫，低溫保存。

1.3.7 冷凍干燥

透析液冷凍干燥，即得魚(yú)皮膠原蛋白提取物。

1.4 膠原蛋白得率的計(jì)算

1.5 魚(yú)皮基本成分分析

水分：GB 5009.3-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》；灰分：GB 5009.4-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定》；蛋白質(zhì)：GB 5009.5-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；脂肪：GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測(cè)定》。

1.6 舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白提取條件單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面設(shè)計(jì)

選取胃蛋白酶添加量，酶提取時(shí)間，酶提取溫度為考察因素，以膠原蛋白提取率為指標(biāo)，在單因素研究的基礎(chǔ)上，采用Design expert軟件設(shè)計(jì)三因素三水平Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)因子編碼見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Level and code of Box-Behnken test factors

2 結(jié)果與分析

2.1 半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1 胃蛋白酶添加量對(duì)半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白提取率的影響

在固定提取時(shí)間6 h，提取溫度4℃的條件下，分別在0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%胃蛋白酶添加量（胃蛋白酶添加量/魚(yú)皮質(zhì)量）提取魚(yú)皮膠原蛋白，考察不同胃蛋白酶添加量對(duì)半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白得率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 胃蛋白酶添加量對(duì)半滑舌鰨魚(yú)皮膠原得率的影響Fig.1 Effect of pepsin addition on the yield of collagen from TS skin

由圖1可知，在0.1%～1%范圍內(nèi)，隨著酶添加量的增加，膠原蛋白得率也隨之增加。當(dāng)添加量為1%時(shí)，提取率最高，為26.7%。當(dāng)酶添加量超過(guò)1%時(shí)，膠原蛋白得率隨著酶添加的升高而降低。

2.1.2 酶提取溫度對(duì)半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白提取率的影響

在固定提取時(shí)間6 h，胃蛋白酶添加量為0.1%的條件下，分別在0、4、10、20、30℃下提取魚(yú)皮膠原蛋白，考察不同酶提溫度對(duì)半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白得率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶提溫度對(duì)半滑舌鰨魚(yú)皮膠原得率的影響Fig.2 Effect of enzymatic temperature on the yield of collagen from TS skin

由圖2可知，膠原得率隨溫度的升高先增加后下降，在0℃～4℃范圍內(nèi)提取率快速升高，當(dāng)溫度達(dá)到4℃左右，膠原蛋白得率達(dá)到最高，當(dāng)溫度在4℃～10℃時(shí)，膠原蛋白得率下降趨勢(shì)不明顯，而超過(guò)10℃后，膠原蛋白得率快速下降。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白提取率的影響

在固定提取溫度為4℃，酶添加量為0.1%的條件下，分別在6、12、18、24、30 h下提取膠原蛋白，考察不同提取時(shí)間對(duì)半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 酶提取時(shí)間對(duì)半滑舌鰨魚(yú)皮膠原得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic time on the yield of collagen from TS skin

由圖3可知，提取時(shí)間6 h～12 h之內(nèi)，膠原蛋白得率隨著提取時(shí)間的增加，上升趨勢(shì)比較明緩慢，而在12 h～18 h之內(nèi)，膠原蛋白得率增速較快，而提取時(shí)間超過(guò)18 h后，膠原蛋白得率隨提取時(shí)間的變化趨勢(shì)較小。

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)最佳條件分析

半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and result of response surface analysis of collagen from TS skin

如表2所示，經(jīng)回歸分析得到膠原得率與影響因素的回歸方程如下：

Y=41.96+1.71A-1.63B+1.89C-6.28A2-3.70B2-3.63C2-0.27AB-1.20AC-0.32BC

半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白得率回歸模型方程方差分析見(jiàn)表3。

表3 半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白得率回歸模型方程方差分析Table 3 Variance analysis of collagen yield regression model of TS skin

由表3可知，膠原得率預(yù)測(cè)方程模型達(dá)到極顯著水平（P=0.001 3＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.053 2＞0.05）說(shuō)明該回歸模型預(yù)測(cè)能力較好，可以用此模型代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)各項(xiàng)方差大小，預(yù)測(cè)提取條件對(duì)膠原蛋白提取率的影響排序?yàn)槊柑崛r(shí)間＞酶添加量＞酶提取溫度。模型的一次項(xiàng)（A、B、C），二次項(xiàng)（A2，B2，C2）的回歸系數(shù)極顯著（P＜0.01），說(shuō)明對(duì)膠原蛋白提取率的影響較大。而其他項(xiàng)不顯著，表明對(duì)膠原蛋白提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。根據(jù)Design Expert軟件分析得出的最佳優(yōu)化條件為：酶添加量為1.06%，提取溫度為3.82℃，提取時(shí)間為19.51 h。在此條件下，半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白得率的預(yù)測(cè)值為42.5%?？紤]到實(shí)際操作，將最優(yōu)提取條件調(diào)整為：酶添加量1.06%，提取溫度4℃，提取時(shí)間19.5 h，此條件下，膠原蛋白得率為42.1%，與預(yù)測(cè)值較符合。

2.3 半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白提取工藝的響應(yīng)面分析

圖4 半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白得率響應(yīng)面圖Fig.4 The response surface of collagen protein from TS skin

半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白提取工藝的響應(yīng)面分析見(jiàn)圖4。如圖4a～圖4c所示，酶添加量、酶提取溫度和酶提取時(shí)間的交互作用的響應(yīng)面圖具有相似的變化趨勢(shì)。但涉及到酶添加量和提取時(shí)間的響應(yīng)面圖變化明顯，而酶提取溫度與其它提取條件的響應(yīng)面圖變化較平緩。因此，在本次考察的酶提工藝中，酶添加量和提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白得率的影響的交互作用比較強(qiáng)。圖4d表明，回歸方程的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值一致性高，進(jìn)一步說(shuō)明回歸方程擬合度高，能較好的預(yù)測(cè)膠原蛋白提取率。

2.4 半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白營(yíng)養(yǎng)分析

半滑舌鰨魚(yú)皮及其提取物營(yíng)養(yǎng)分析見(jiàn)表4。

表4 半滑舌鰨魚(yú)皮及其提取物營(yíng)養(yǎng)分析Table 4 Nutritional analysis of the TS skin and its collagen extract

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)探討了胃蛋白酶添加量，酶解溫度，酶解時(shí)間對(duì)半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白提取的影響。采用響應(yīng)面分析建立的半滑舌鰨魚(yú)皮膠原蛋白提取回歸模型方程顯著，可用于預(yù)測(cè)魚(yú)皮膠原蛋白得率。最優(yōu)工藝條件：酶添加量為1.06%，提取溫度為4℃，提取時(shí)間為19.5 h。在此條件下，半滑舌鰨魚(yú)皮膠原提取率為42.1%。本試驗(yàn)中，最優(yōu)工藝條件下提取的半滑舌鰨魚(yú)皮膠原粗蛋白含量為89.76%，粗脂肪含量為0.81%，灰分含量為1.37%，水分含量7.52%。本工藝條件不僅保證了較高的魚(yú)皮膠原蛋白得率，而且較大降低了粗脂肪、水分的含量，符合食品行業(yè)應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)。

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Extraction Optimization of Collagen from the Skin of Half-smooth Tongue Cole（Cynoglossus semilaevis Gunther）Using Resonse Surface Methodology

LIU Kuan，SU Jia，YANG Yun-xuan，ZHANG Lu，HE Qing-feng*
（College of Food Science and Bioengineering，Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China）

Half smooth tongue sole is widely cultured and edible in coastal area.Half smooth tongue skin was considered to be one of potential resources for the preparation of food collagen.Response surface method was used to optimize the processing conditions for the extraction of collagen from half-smooth tongue sole skin.Con

centration of pepsase，extraction time and temperature were selected as the independent variables.The results showed that the most suitable conditions for maximum collagen yield were the pretreatment with 1.06%pepsase ratio at 4℃for 19.5 h.The obtained collagen yield from the optimal conditions was 42.1%.The further nutrition analysis revealed that the obtained tongue sole（TS）collagen contained the content of 89.76%crude protein，1.37%ash，0.81%fat and 7.52%water content.

half-smooth tongue sole；collagen；fish skin；response surface methodology

2016-11-15

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510061099）

劉寬（1992—），男（漢），本科，研究方向：食品質(zhì)量與安全。

*通信作者：何慶峰（1979—），男（漢），講師，博士研究生，研究方向：食品安全與毒理。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.006