孔曉瑜，羅海容，THOMAS A.Munroe

(1.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510301；2.美國(guó)史密斯自然博物館國(guó)家系統(tǒng)研究室，華盛頓特區(qū) MRC-153)

根據(jù) Eschmeyer’s Catalog of Fishes 數(shù)據(jù)庫(kù)，舌鰨科(Cynoglossidae)的舌鰨屬(Cynoglossus)約75 種有效種，其中有眼側(cè)具三條完整側(cè)線和無(wú)眼側(cè)無(wú)側(cè)線約有31 種,由于一些種類的形態(tài)特征高度相似，導(dǎo)致了種名的混亂[1-2]，例如短吻三線舌鰨(C.abbreviatus，Gray，1834)、褐斑三線舌鰨(C.trigrammus，Günther，1862)和紫斑舌鰨(C.purpureomaculatus，Regan，1905)[3-5]的種類有效性和同物異名關(guān)系就存在不同觀點(diǎn)，包括只有短吻三線舌鰨為有效種；短吻三線舌鰨和褐斑三線舌鰨均為有效種，而紫斑舌鰨是褐斑三線舌鰨的次同物異名；三個(gè)名義種均為有效種。

1880 年，Peters[6]指出褐斑三線舌鰨和短吻三線舌鰨具有相同形狀和顏色的奇鰭，應(yīng)被視為同一物種。1977 年Menon[1]在舌鰨屬形態(tài)特征的系統(tǒng)論著中，將紫斑舌鰨和褐斑三線舌鰨均視為短吻三線舌鰨的次同物異名。他將紫斑舌鰨的正模標(biāo)本以及褐斑三線舌鰨的選模和副選模標(biāo)本分別與采集自模式產(chǎn)地的短吻三線舌鰨的形態(tài)特征進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示比較的三種舌鰨的形態(tài)特征均一致或相似，認(rèn)為是種內(nèi)差異。例如紫斑舌鰨的上中側(cè)線間鱗數(shù)19 枚和褐斑三線舌鰨的21枚均落在了短吻三線舌鰨的18～23 枚內(nèi)。

Matsubara[7]、Ochiai[8]和陳大剛等[9]均認(rèn)為紫斑舌鰨是褐斑三線舌鰨的次同物異名，短吻三線舌鰨是有效種。李思忠等[10]和伍漢霖等[11]都認(rèn)為，3 個(gè)種類為有效種類。另外，還有些研究只涉及到1 種或是2 種的描述或者紀(jì)錄，并沒(méi)有涉及到種類的有效性問(wèn)題[12-18]。

近年來(lái)，學(xué)者對(duì)短吻三線舌鰨、紫斑舌鰨和褐斑三線舌鰨進(jìn)行了分子分類研究。短吻三線舌鰨和紫斑舌鰨間的核糖體和線粒體分子片段包括ITS-1 (0.002 5)、16SrRNA(0.002)、CytB(0.001)和COⅠ (0.000～0.002)的K2P 遺傳距離均顯示同種關(guān)系，但褐斑三線舌鰨與這兩種舌鰨的16SrRNA(0.053～0.055)、CytB(0.142～0.144)和COⅠ(0.130～0.130) 的K2P 遺傳距離則為種間差異[19-22]。

根據(jù)FishBase[19]數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，三個(gè)種類的分布比較狹窄，短吻三線主要分布在菲律賓、中國(guó)、印度尼西亞、日本和韓國(guó)；紫斑分布在越南、中國(guó)和日本；褐斑三線主要分布在泰國(guó)、越南、中國(guó)和日本，并且個(gè)體數(shù)量也有限，相對(duì)的研究也較少。迄今，在涉及魚(yú)類種名查詢的主要網(wǎng)站上，如 FishBase、Eschmeyer's Catalog of Fishes、WoRMS(World Registerof Marine Species)等，三種類都是有效種類[2，23-24]。綜上所述，三種舌鰨的形態(tài)特征和分子的研究結(jié)果均表明短吻三線舌鰨有效種的地位未受質(zhì)疑，但褐斑三線舌鰨以及紫斑舌鰨是有效種還是同物異名的問(wèn)題仍然沒(méi)有解決。

因此，本研究基于2006—2022 年采集自中國(guó)大陸沿海的標(biāo)本，以及標(biāo)本館館藏的3 種類模式標(biāo)本，運(yùn)用形態(tài)特征比較和分子條形碼判別相結(jié)合的方法，對(duì)以上分類地位有分歧的褐斑三線舌鰨和紫斑舌鰨的有效性進(jìn)行了研究，以期為鰈形目魚(yú)類的正確分類提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究測(cè)量了采集自中國(guó)大陸沿海的8 尾短吻三線舌鰨、8 尾褐斑三線舌鰨和6 尾紫斑舌鰨的非模式標(biāo)本(圖1)，模式產(chǎn)地在中國(guó)的短吻三線舌鰨 (BMNH 2004.11.5.1) 和褐斑三線舌鰨(BMNH 1856.9.19.1215)的選模標(biāo)本，以及日本瀨戶內(nèi)海的紫斑舌鰨的正模標(biāo)本(BMNH 1905.6.6.247) (圖2)。開(kāi)頭縮寫(xiě)為SCF 的樣品存放在廣州中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，縮寫(xiě)為BMNH 的樣品存放在英國(guó)自然歷史博物館。由于標(biāo)本從碼頭或魚(yú)類市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，故沒(méi)有捕獲深度或經(jīng)緯度等信息，標(biāo)本的采集時(shí)間及地點(diǎn)等信息見(jiàn)表1。新鮮標(biāo)本在采集后立即保存在碎冰中，隨后在實(shí)驗(yàn)室-20 °C冷凍或固定在95%乙醇中以備下一步實(shí)驗(yàn)。

表1 本研究測(cè)量的三種魚(yú)類非模式標(biāo)本的信息Tab.1 Sample information of non-type specimens of three species measured in this study

圖1 中國(guó)大陸沿海采集的短吻三線舌鰨(a、d)、褐斑三線舌鰨(b、e)和紫斑舌鰨(c、f)非模式標(biāo)本的照片F(xiàn)ig.1 Photos of both sides of non-type specimens of C.abbreviatus (a,d)，C.purpureomaculatus (b,e) and C. trigrammus (c,f) collected from Chinese waters in this study

圖2 三種舌鰨的有眼側(cè)和無(wú)眼側(cè)照片(a) (d)短吻三線舌鰨(BMNH 2004.11.5.1)，(b) (e)褐斑三線舌鰨選模標(biāo)本(BMNH 2004.11.5.1)，(c) (f)紫斑舌鰨正模標(biāo)本(BMNH 1905.6.6.247)。照片均下載自英國(guó)自然歷史博物館。Fig.2 Photos of both sides of three species(a) (d) lectotype of C.trigrammus (BMNH 2004.11.5.1);(b) (e) lectotype of C.abbreviatus (BMNH 2004.11.5.1);(c) (f) holotype of C.purpureomaculatus (BMNH 1905.6.6.247).Photos are download from the Natural History Museum,London.

1.2 形態(tài)特征方法

本研究對(duì)三個(gè)種類的28 個(gè)形態(tài)特征進(jìn)行了比較分析(表2)，包括8 個(gè)可數(shù)特征，16 個(gè)可量特征的比例值和4 個(gè)描述特征。8 個(gè)可數(shù)特征包括背鰭條數(shù) (dorsal-fin rays，DFR)、臀鰭條數(shù) (analfin rays，AFR)、尾鰭條數(shù) (caudal-fin rays，CFR)、中側(cè)線鱗數(shù) (midlateral-line scales，MLL)、上中側(cè)線間鱗數(shù) (scale rows between dorsolateral line and midlateral line，DMLL)、腹椎骨數(shù)(abdominal vertebrae，AV)、尾椎骨數(shù)(caudal vertebrae，CV)和全椎骨個(gè)數(shù) (total vertebrae，TV)。16 個(gè)可量特征：1.體長(zhǎng)(standard length，SL)，2.體寬(body depth，BD)，3.頭長(zhǎng)(head length，HL)，4.頭寬(head width，HW)，5.吻長(zhǎng)(snout length，SNL)，6.下眼眼徑(diameter of orbit of lower eye，LED)，7.眼間距(interorbital width，IOW)，8.吻端到嘴角長(zhǎng)(distance between snout tip to angle of mouth，DSM)，9.嘴角到鰓蓋后緣長(zhǎng)(distance between angle of mouth to opercular margin，AMO)，10.有眼側(cè)上頜長(zhǎng)(length of ocular-side upper jaw，UJL)，11.眼后頭長(zhǎng)(postorbital head length，POL)，12.頭上葉長(zhǎng)(upper head lobe，UHL)，即從鰓裂上端點(diǎn)至背鰭基部的垂直距離，13.頭下葉長(zhǎng)(lower head lobe，LHL)，即從鰓裂上端點(diǎn)至頭部腹側(cè)邊緣的垂直距離，14.肛前距(preanal length，PAL)，15.腹鰭長(zhǎng)(pelvic-fin length，PFL)和16.尾鰭長(zhǎng)(caudal-fin length，CFL)。以上特征使用游標(biāo)卡尺測(cè)量，精確到0.1 mm。鰭條數(shù)的計(jì)數(shù)根據(jù)X-ray 照片或從標(biāo)本直接計(jì)數(shù)；椎骨數(shù)從魚(yú)的X-ray 照片計(jì)數(shù)；其他可數(shù)特征直接從標(biāo)本計(jì)數(shù)。中側(cè)線鱗計(jì)數(shù)是從鰓蓋后緣與中側(cè)線的垂直交點(diǎn)到尾鰭起始處與中側(cè)線的垂直交點(diǎn)之間的側(cè)線鱗數(shù)。為了消除個(gè)體大小對(duì)結(jié)果的影響，將上述可量性狀的特征值換算為16 個(gè)與體長(zhǎng)或頭長(zhǎng)的比例值。4 個(gè)描述特征分別為吻長(zhǎng)與上眼上緣距背鰭基部相對(duì)長(zhǎng)度、口裂后緣相對(duì)下眼后緣的位置、魚(yú)體兩側(cè)鱗片的類型和有眼側(cè)的花色特征。

表2 三種魚(yú)類非模式標(biāo)本和模式標(biāo)本形態(tài)特征值的比較Tab.2 Morphological characters of three nominal species examined in this study and recorded in the original description

1.3 分子方法

擴(kuò)增了短吻三線舌鰨和紫斑舌鰨各4 尾，褐斑三線舌鰨2 尾代表樣品的COⅠ序列(表1)。每個(gè)樣品取約30 mg 的肌肉組織，用海洋動(dòng)物組織基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取DNA，加雙蒸水溶解后保存于-20 °C 冰箱中。COI 的引物為：正向5′-CTAAGCCATCCT ACCTGTG-3′，反向5′-TCAACTCCTCCCTTTCT CG-3′。

PCR 的反應(yīng)體系為20 μL：1 μL 的DNA 模板(50 ng/L)，1 μL 正反引物各(10 μmol/L)，0.2 μL 的5 U/μL LATaq酶(TaKaRa，大連)，2 μL 的10 × LATaqBuffer Ⅱ (Mg2+Plus)，3.2 μL 的dNTP Mixture 液(2.5 mmol/L)，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)在ABI Veriti 96 孔梯度PCR 儀(美國(guó))中進(jìn)行，反應(yīng)程序：在95 °C 預(yù)變性3 min，95 °C 變性30 s，48 °C 復(fù)性40 s 和68 °C 延伸1～2 min，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)后72 °C 延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段，將含有目標(biāo)DNA 片段的產(chǎn)物送上海英濰捷公司ABI 3730 DNA sequencer (Applied Biosystems，美國(guó))進(jìn)行雙向測(cè)序。獲得的10 條COⅠ分子序列的GenBank 編號(hào)為MN757887～MN757896。

同時(shí)從GenBank 上下載了2 條短吻紅舌鰨(C.joyneri)COⅠ分子序列(MK838469 和MK838473)，使用MEGA 6.0 軟件中的Kimura 雙參數(shù)(K2P) 模型計(jì)算不同序列間的遺傳距離。

2 結(jié)果

本研究綜合了短吻三線舌鰨、紫斑舌鰨和褐斑三線舌鰨的原始描述，以及自測(cè)的3 尾模式標(biāo)本和22 尾非模標(biāo)本的28 個(gè)形態(tài)特征，并進(jìn)行了種間特征比較(表2，圖1，圖2)。結(jié)果顯示，三個(gè)種的8 個(gè)可數(shù)和16 個(gè)可量特征的比例數(shù)值為一致、包含或大部分重疊關(guān)系，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的區(qū)別，由此可以顯示這些種類的形態(tài)特征非常相似。

在4 個(gè)描述特征中，1 個(gè)相同，1 個(gè)連續(xù)，2個(gè)存在明顯差別；相同的特征是身體兩側(cè)鱗片均為櫛鱗；在口裂后緣相對(duì)下眼后緣位置的特征是連續(xù)的，短吻三線舌鰨和紫斑舌鰨為口裂后緣接近或達(dá)到下眼后緣，褐斑三線舌鰨為略過(guò)下眼后緣；一個(gè)明顯差異特征是短吻三線舌鰨和紫斑舌鰨的吻長(zhǎng)與上眼上緣距背鰭基部的長(zhǎng)度都近乎相同(即略長(zhǎng)、等長(zhǎng)或略短)，而褐斑三線舌鰨則吻長(zhǎng)明顯長(zhǎng)于上眼上緣距背鰭基部；另一個(gè)明顯差異特征是三種舌鰨花色的不相同，紫斑舌鰨有眼側(cè)體表為黃褐色、褐色或紅棕色，并且有眼側(cè)體表密布著小于1/3 眼球大小的深棕色不規(guī)則的斑紋；短吻三線舌鰨的有眼側(cè)無(wú)明顯斑點(diǎn)，為著色不均勻的黃褐色、褐色或紅棕色；褐斑三線舌鰨為棕色或黃棕色，有眼側(cè)鰓部至體前3/4 處之間有明顯稀疏的2～5 倍眼球大小的褐色云狀斑(圖1)。

本研究獲得了4 尾短吻三線舌鰨、4 尾紫斑舌鰨和2 尾褐斑三線舌鰨的527 bpCOⅠ序列片段，計(jì)算了它們之間的K2P 遺傳距離，結(jié)果顯示，短吻三線舌鰨和紫斑舌鰨的種內(nèi)和種間遺傳距離均為0.000～0.002(表3)，明顯小于Hebert 等2003 年提出的魚(yú)類COⅠ條形碼種間遺傳距離的最小值0.020[25]，說(shuō)明短吻三線舌鰨和紫斑舌鰨為相同物種；褐斑三線舌的種內(nèi)遺傳距離為0.000，與其他兩種舌鰨之間的遺傳距離為0.141～0.145，屬于明顯的種間差異(表3)。

表3 三種舌鰨之間的COⅠ K2P 遺傳距離Tab.3 The K2P genetic distances of COⅠ between three nominal tongue fishes

從以上形態(tài)和分子的比較分析結(jié)果可以看出，短吻三線舌鰨和紫斑舌鰨在27 個(gè)形態(tài)特征和分子條形碼上均無(wú)種間差異，但在花色特征上存在差異，還發(fā)現(xiàn)短吻三線舌鰨樣品與紫斑舌鰨相比體長(zhǎng)相對(duì)較大。因此，本研究進(jìn)一步增加了這兩種舌鰨的樣品，為紫斑舌鰨73 尾、短吻三線舌鰨77 尾，對(duì)它們的花色和體長(zhǎng)相關(guān)性做了分析。結(jié)果顯示紫斑舌鰨斑紋清晰的樣品體長(zhǎng)在200 mm以下，個(gè)別斑紋模糊的樣品體長(zhǎng)為150～250 mm；短吻三線舌鰨雖少量著色不均勻但無(wú)斑，其體長(zhǎng)基本為200～270 mm。由此可以看出，這兩個(gè)名義種的花色不同與個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，即在中小個(gè)體存在的明顯斑點(diǎn)隨體長(zhǎng)增加而逐漸淡化，故大個(gè)體為模糊的斑點(diǎn)或者無(wú)斑，僅少量著色不均勻。因此，花色特征不能作為兩種類的鑒別特征。

綜合以上形態(tài)和分子的結(jié)果，本研究認(rèn)為紫斑舌鰨與短吻三線舌鰨為同一物種，且前者是后者的次同物異名，而褐斑三線舌鰨是有效種。

根據(jù)短吻三線舌鰨和紫斑舌鰨的模式標(biāo)本、本研究自測(cè)樣品(表2)和以往數(shù)據(jù)的綜合，對(duì)短吻三線舌鰨的主要形態(tài)特征進(jìn)行了如下再描述：背鰭條數(shù)121～131，臀鰭條數(shù)100～107，腹鰭條數(shù)4，尾鰭條數(shù)8，全椎骨數(shù)60～63 (胸椎骨數(shù)9～10，尾椎骨數(shù)50～53)，中側(cè)線鱗數(shù)107～124，上中側(cè)線間鱗數(shù)17～21。吻前端鈍，吻長(zhǎng)基本等長(zhǎng)于上眼距背鰭基部，眼間隔窄，吻鉤達(dá)前鼻孔下方或略過(guò)，口裂后緣接近下眼后緣或達(dá)下眼后緣。

有眼側(cè)體表為黃褐色、褐色或紅棕色，且斑紋隨體長(zhǎng)增加而逐漸淡化；體長(zhǎng)范圍在200 mm以下的中小個(gè)體體表密布著小于1/3 眼球大小的深棕色不規(guī)則斑紋，且奇鰭向末端著色加深；體長(zhǎng)范圍為200 mm 及以上的大個(gè)體體表為模糊的斑點(diǎn)，或者無(wú)斑，僅少量著色不均勻，奇鰭有明顯白邊且末端較黑。在中國(guó)主要分布于黃渤海、東海和南海，以小魚(yú)、甲殼類為食。

3 討論

以往研究中區(qū)別短吻三線舌鰨和紫斑舌鰨主要有5 個(gè)特征，包括鰭條數(shù)、上中側(cè)線間鱗數(shù)、眼徑頭長(zhǎng)比、吻長(zhǎng)與上眼距背鰭基部相對(duì)長(zhǎng)短以及口裂后緣和下眼后緣的相對(duì)位置。例如在有些研究中的區(qū)別分別為上中側(cè)線間鱗數(shù)(16～18vs.19～20)和眼徑頭長(zhǎng)比(11.5%～13.9%vs.10.3%)[10,12,14,16]，比較這些數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)它們和本研究獲得的短吻三線舌鰨的上中側(cè)線間鱗數(shù)(17～21)和眼徑頭長(zhǎng)比(6.9%～12.5%)均大范圍重疊，因此，這兩個(gè)特征不能作為種類的區(qū)別特征。

Wu[12]和李思忠等[10]指出，紫斑舌鰨相對(duì)于短吻三線舌鰨具有稍長(zhǎng)或長(zhǎng)于上眼距背鰭基部的吻長(zhǎng)，但都沒(méi)有具體的數(shù)據(jù)，根據(jù)本研究結(jié)果，這兩種魚(yú)類的這一特征則近乎相同(即略長(zhǎng)、等長(zhǎng)或略短于)，因此該特征也不能作為種類的區(qū)別特征。

李思忠等[10]認(rèn)為的紫斑舌鰨與短吻三線舌鰨口裂后緣和下眼后緣相對(duì)位置的特征差別在于前者口裂后緣約達(dá)下眼中央或略后下方，后者達(dá)下眼后緣稍前方。據(jù)此觀點(diǎn)，這兩種舌鰨在該特征上的最大差異距離是從下眼中央至下眼后緣稍前方，該距離小于眼徑的一半。本研究特別測(cè)量了14 尾體長(zhǎng)為95.9～240.3 mm 短吻三線舌鰨的下眼徑長(zhǎng)為1.6～4.7 mm，即使是最大眼徑的一半長(zhǎng)度也僅約2.4 mm，差異范圍太小，不適用于種類的區(qū)分。

Peters[6]認(rèn)為褐斑三線舌鰨和短吻三線舌鰨是同一物種的依據(jù)是相同的奇鰭形狀和顏色，綜合目前舌鰨屬魚(yú)類的分類鑒別特征可以發(fā)現(xiàn)，除了該學(xué)者，沒(méi)有其他學(xué)者認(rèn)為這是個(gè)種類間的區(qū)別特征；并且本研究中褐斑三線舌鰨并不具有短吻三線舌鰨尾鰭末端著色加深的特點(diǎn)，同時(shí)根據(jù)這兩種舌鰨在花色特征和吻長(zhǎng)與上眼上緣距背鰭基部的相對(duì)長(zhǎng)度上，以及分子結(jié)果上的明顯差異，說(shuō)明它們是不同種，因此Peters[6]的觀點(diǎn)不予參考。

對(duì)于Menon[1]認(rèn)為紫斑舌鰨和褐斑三線舌鰨均為短吻三線舌鰨次同物異名的研究，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)他依據(jù)的是種類之間的可數(shù)可量特征和無(wú)眼側(cè)的鱗片類型沒(méi)有明顯差異得出的，從本研究對(duì)24 個(gè)可數(shù)和可量特征的比例值的比較可以看出，這三種魚(yú)類的確非常相似，不能作為種類間的區(qū)別特征。同時(shí)根據(jù)文章中描述的短吻三線舌鰨有眼側(cè)有或無(wú)黑斑可以看出，他并不認(rèn)為斑紋是種類的區(qū)別特征。斑紋特征在鑒別舌鰨種類的應(yīng)用中的確非常多樣，在本研究中對(duì)三種類間的斑紋和分子數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)短吻三線舌鰨和紫斑舌鰨之間的斑紋差異是同一種類在不同生長(zhǎng)階段的花紋變化，不能作為種類之間的區(qū)別特征，而褐斑三線舌鰨存在的與前兩個(gè)名義種不同的斑紋和明顯的分子條形碼差異，說(shuō)明它們是不同種類，斑紋則可以作為其鑒別特征。

因此，可以看出花色特征在物種鑒別時(shí)是否能作為種類的區(qū)分特征是不確定的，有時(shí)花色可作為不同物種間的鑒別特征，如花斑可以用來(lái)鑒別褐斑三線舌鰨。但同一物種的不同發(fā)育階段的花色變化又會(huì)混淆種類的鑒定，如短吻三線舌鰨和日本須鰨均存在不同的體長(zhǎng)范圍下具有不同的花色特征[26]。因此，花色是否能作為舌鰨類的區(qū)別特征需要形態(tài)和分子方法等多方面的綜合研究來(lái)確定。需要指出的是，分子條形碼在經(jīng)典形態(tài)分類中很難有效鑒別相似種，或在同種間存在多種花色時(shí)可以作為一個(gè)重要的鑒別手段。

感謝Maclaine J.和Taylor H.(倫敦自然歷史博物館)提供短吻三線舌鰨、紫斑舌鰨和褐斑三線舌鰨模式標(biāo)本的照片，以及Raredon S.J.和Clayton J.(史密森尼學(xué)會(huì)美國(guó)國(guó)家自然歷史博物館)在查找樣品和拍攝X 射線照片中提供的幫助。

（作者聲明本文無(wú)實(shí)際或潛在的利益沖突）