易艷紅，董梅，黃莉

(廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科，廣東廣州510010)

凍融后不同時期和數(shù)目胚胎移植的臨床妊娠結局比較

易艷紅，董梅，黃莉

(廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科，廣東廣州510010)

目的比較凍融后對不同時期和數(shù)目的胚胎進行移植的臨床妊娠結局。方法選取廣東省婦幼保健院2014年7月至2015年7月期間進行玻璃化冷凍并復蘇培養(yǎng)的胚胎作為研究對象，共992個移植周期，均對D3卵裂期胚胎進行玻璃化冷凍后復蘇，培養(yǎng)1 d后進行移植。根據(jù)移植胚胎數(shù)目和桑椹胚數(shù)目分為單個胚胎移植[非桑葚胚組(移植1個非桑葚胚，n=41)、桑葚胚組(移植1個桑葚胚，n=28)]和兩個胚胎移植[桑葚胚M0組（移植2個非桑椹胚，n=290)、桑葚胚M1組(移植1個非桑椹胚和1個桑葚胚，n=378)、桑葚胚M2組（移植2個桑葚胚，n=255）]，分析各組間臨床妊娠率、流產(chǎn)率、宮外孕率以及早產(chǎn)率。結果單個胚胎移植時，桑葚胚組和非桑葚胚組的臨床妊娠率(28.57%vs 29.27%)、流產(chǎn)率(5.00%vs 33.33%)、宮外孕率(0 vs 0)和早產(chǎn)率(12.50%vs 8.33%)比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；兩個胚胎移植時，隨著移植桑葚胚數(shù)目的增加(桑葚胚M0組→桑葚胚M1組→桑葚胚M2組)，臨床妊娠率顯著增加(42.41%→53.17%→66.27%)，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；桑葚胚M0組、桑葚胚M1組和桑葚胚M2組的宮外孕率(2.44%vs 3.98%vs 2.37%)、流產(chǎn)率(11.38%vs 10.06%vs 12.94%)和早產(chǎn)率(19.51%vs 17.41%vs 24.26%)比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論進行體外受精-胚胎移植時，選擇D3胚胎解凍培養(yǎng)至桑葚胚期再行移植，能有效提高臨床妊娠率，且不增加宮外孕、流產(chǎn)和早產(chǎn)的風險。

妊娠；胚胎；移植；玻璃化冷凍；桑葚期

隨著生活和工作壓力的增加，不孕癥、晚育等情況日益嚴重。近些年隨著輔助生殖技術的發(fā)展，有學者提出胚胎冷凍技術，該技術是女性保有生育能力的有效方式，同時是提高臨床妊娠率的重要手段[1]。目前臨床對女性卵母細胞冷凍保存方式分為玻璃化冷凍、快速程序化冷凍，但有學者研究發(fā)現(xiàn)前者在胚胎、胚母細胞保存上優(yōu)于后者?，F(xiàn)今胚胎冷凍多對卵裂期胚胎、原核、囊胚期胚胎進行，對于胚胎冷凍復蘇后培養(yǎng)至桑葚期的研究還較少[2-3]。我院對D3期胚胎凍融后在體外培養(yǎng)1 d達到桑葚期再行胚胎移植，發(fā)現(xiàn)患者妊娠率上升，且為增加各種孕產(chǎn)婦并發(fā)癥的發(fā)生率，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料選取廣東省婦幼保健院2014年7月至2015年7月期間進行玻璃化冷凍并復蘇培養(yǎng)1 d的胚胎作為研究對象，共992個移植周期?；颊呔鶎Φ?天卵裂期胚胎(D3)玻璃化冷凍后進行復蘇，培養(yǎng)1 d后進行移植。根據(jù)移植胚胎數(shù)目和桑椹胚數(shù)目分為單個胚胎移植[非桑葚胚組(移植1個非桑葚胚，n= 41)、桑葚胚組(移植1個桑葚胚，n=28)]和兩個胚胎移植[桑葚胚M0組(移植2個非桑椹胚，n=290)、桑葚胚M1組(移植1個非桑椹胚和1個桑葚胚，n=378)桑葚胚M2組(移植2個桑葚胚，n=255)]。行體外受精胚胎移植患者無相關精神病史，可積極配合醫(yī)生治療，有良好依從性，入選患者均簽署知情同意書并通過醫(yī)院倫理學委員會批準。所有患者前期均按常規(guī)進行排卵、取卵、體外受精、培養(yǎng)，各組接受胚胎移植者年齡相當，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 胚胎冷凍標準本次所選用的胚胎均根據(jù)國際第3天胚胎形態(tài)特征，選擇卵裂期胚胎碎片小于15%且細胞數(shù)在5個以上，細胞卵裂球均勻，同時征得患者同意并進行保存。

1.2.2 冷凍方法本次所有胚胎均采用玻璃化冷凍，試劑購自廣州尊博醫(yī)療器械有限公司。將冷凍試劑取出放置至室溫，將1～3枚胚胎放入V1液中5 min，接著將胚胎移入V2液中2 min，然后移入V3液中30 s，吹打3次后迅速將胚胎放入自制冷凍載體上，封管并將其置入液氮中，需注意從封管到移入液氮整個過程要迅速，不能超過70 s。

1.2.3 胚胎解凍方法使用無菌手術剪剪掉麥管封口，取出胚胎并置于1 mol/L蔗糖復蘇液1中，需注意此過程要迅速進行，浸泡1 min后將胚胎移入0.5 mol/L蔗糖復蘇液2中，浸泡時間為2 min，后將胚胎移入0.25 mol/L蔗糖復蘇液3中，此次浸泡時間為3 min，最后將胚胎移入囊胚培養(yǎng)液并置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d。

1.2.4 患者準備對于排卵無異常、經(jīng)期規(guī)律者采用自然周期，在陰道超聲技術輔助下監(jiān)測患者內(nèi)膜、卵泡發(fā)育情況，在患者子宮內(nèi)膜厚度達到8 mm以上、卵泡直徑在16 mm以上時，檢查機體是否出現(xiàn)黃體生成素(LH)峰。一般卵巢排卵在LH峰后36 h左右，患者排卵日開始黃體支持(黃體酮20 mg/d肌注或HCG 2 000 IU，3 d一次，共5次，或雪諾酮陰道栓90 mg/d置陰道)，并在排卵后第3天解凍胚胎。對于有排卵障礙、經(jīng)期無規(guī)律、子宮內(nèi)膜發(fā)育異?；颊呤褂眉に靥娲芷冢颊哂诮?jīng)期第3天開始口服激素藥物戊酸雌二醇，采用遞增法服藥，同時監(jiān)測其內(nèi)膜厚度，當內(nèi)膜厚度達到8 mm以上時開始黃體支持，并于3 d后解凍胚胎。

1.3 觀察指標患者胚胎移植2周后，對血人絨毛促性腺激素(HCG)進行檢測，陽性者判斷為生化妊娠，對于此類移植者可在2周后進行陰道B超檢查，臨床以B超檢查發(fā)現(xiàn)孕囊、心管搏動為妊娠標準。統(tǒng)計分析不同組別患者臨床妊娠率、流產(chǎn)率、宮外孕率以及早產(chǎn)率。

1.4 統(tǒng)計學方法應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用百分比表示，所有理論數(shù)T≥5并且總樣本量n≥40，用χ2檢驗；如有理論數(shù)1≤T＜5，并且n≥40，用校正χ2檢驗；如果有理論數(shù)T＜1或n＜40，則用確切概率法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 單個胚胎移植時兩組臨床結局比較單個胚胎移植時，桑葚胚組和非桑葚胚組的臨床妊娠率、流產(chǎn)率、宮外孕率和早產(chǎn)率比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 單個胚胎移植時兩組患者妊娠結局比較[例（%）]

2.2 兩個胚胎移植時三組臨床結局比較移植2個胚胎時的臨床妊娠率顯著提高，且流產(chǎn)率有所下降，而宮外孕率和早產(chǎn)率的變化不大。根據(jù)移植桑葚胚數(shù)量不同可發(fā)現(xiàn)，兩個胚胎移植時，隨著移植桑葚胚數(shù)目的增加(桑葚胚M0組→桑葚胚M1組→桑葚胚M2組)，臨床妊娠率明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，宮外孕率、流產(chǎn)率和早產(chǎn)率組間比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 移植兩個胚胎患者妊娠結局比較[例（%）]

3 討論

隨著輔助生殖技術的快速發(fā)展，不孕不育的情況得到了極大改善，而胚胎質(zhì)量在其中具有關鍵性的作用。因此，如何通過提高胚胎質(zhì)量來增加不孕不育患者的妊娠率是輔助生殖技術中迫切需要改善的問題。

目前臨床上對胚胎的保存多采用玻璃化冷凍技術，此冷凍方式是通過冷凍保護劑將胚胎細胞中水分置換出來，并對其進行急速降溫，使水分由液態(tài)轉化為外觀玻璃狀的非晶體化固體狀態(tài)，起到避免細胞受損的作用。臨床多采用第3天卵裂期胚胎進行冷凍，其胚胎復活率高、妊娠率高，但對于胚胎解凍后在體外培養(yǎng)1～4 d進入桑葚期再行胚胎移植的報道并不多見[4-5]。桑葚期胚胎指胚胎細胞在此時期出現(xiàn)融合、半融合或出現(xiàn)腔很小的囊胚，桑葚期臨床可分為三個階段，桑葚早期胚胎細胞一般在8個左右，且各細胞之間會出現(xiàn)融合跡象，但單個細胞仍可較好辨認出現(xiàn)；桑葚中期有90%以上胚胎細胞融合在一起，并形成一個近似正圓形的細胞球，此時期各細胞之間膜界限不再清晰，整個胚胎像一個大細胞；但到了晚期各胚胎細胞之間界限會再次顯現(xiàn)，細胞數(shù)量明顯增多，同時部分細胞會呈現(xiàn)月牙形、梭形，且有小腔隙在各細胞之間出現(xiàn)，從而形成初期囊胚[5]。有學者認為，桑葚期胚胎細胞處于融合、半融合狀態(tài)，部分細胞還會形成早期囊胚，各細胞之間膜緊密連接形成了網(wǎng)狀結構，形成了胚胎骨架，對母體出現(xiàn)的一些劇烈變化有良好抵御效果，避免臨床出現(xiàn)流產(chǎn)等不良反應，從而提高妊娠率[6]。

本研究中，移植2個胚胎時的臨床妊娠率顯著比移植單個胚胎時高，且流產(chǎn)率有所下降，而宮外孕率和早產(chǎn)率的變化不大。當移植的2個胚胎均為非桑葚胚時臨床妊娠率最低，而隨著移植桑葚胚數(shù)量的增加，其臨床妊娠率也隨著增長，且不會增加宮外孕率、流產(chǎn)率和早產(chǎn)率。因此，D3胚胎復蘇培養(yǎng)1 d至桑葚胚再行移植具有良好的臨床效果，能顯著增加臨床妊娠率。但移植單個胚胎時，是否移植桑葚胚并不影響臨床妊娠率，這可能與研究的例數(shù)少有關。雖然Rato等[7]的研究認為，胚胎解凍后培養(yǎng)2～5 h進行移植，其種植率及活產(chǎn)率均高于解凍后培養(yǎng)24 h，說明延長體外培養(yǎng)時間并無顯著效果。但近年來越來越多的研究表明，對于慢速冷凍的D3胚胎或囊胚，延長培養(yǎng)時間有利于提高胚胎種植成功率[8-9]。發(fā)育潛力高的胚胎與子宮內(nèi)膜成熟度的提高，均有利于胚胎著床[10]。龔紹瓊[11]認為提前解凍培養(yǎng)、選擇進一步卵裂的胚胎進行移植，有助于提高FET周期臨床妊娠率，改善妊娠結局。不少研究表明，延長胚胎復蘇后的體外培養(yǎng)時間，相比于解凍當日移植的胚胎，其妊娠率和種植率均可明顯提高[12-14]。

綜上所述，臨床上對患者進行體外受精胚胎移植時，選擇體外培養(yǎng)1 d進入桑葚期胚胎細胞進行移植，可有效保證胚胎質(zhì)量，提高臨床妊娠率，值得臨床推廣。

[1]張夢苑,陳柯屹,臘曉琳,等.新鮮胚胎與冷凍胚胎移植在體外受精周期中療效比較的Meta分析[J].中國組織工程研究,2013,17(53)：9245-9250.

[2]劉艷麗,王興玲,郝大勇,等.不同冷凍方案對人早期胚胎發(fā)育潛能的影響[J].中國婦幼保健,2013,28(25)：4175-4178.

[3]曹金鳳,崔娜,趙志明,等.桑葚期胚胎玻璃化冷凍在體外受精-胚胎移植中的應用[J].實用婦產(chǎn)科雜志,2013,29(10)：785-787.

[4]趙曉徽,岳天孚,隨笑琳.玻璃化法凍融小鼠桑葚胚期和囊胚期胚胎的效果觀察[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2004,39(8)：526-528.

[5]曹金鳳,趙志明,郝桂敏,等.玻璃化冷凍法在人桑葚胚胎和卵裂期胚胎凍融周期中的臨床研究[J].河北醫(yī)藥,2012,34(10)：1448-1450.

[6]趙忠偉,白曉紅,呂睿,等.體外受精-胚胎移植中胚胎種植影響因素的logistic回歸分析[J].中國計劃生育學雜志,2013,21(10)：681-684.

[7]Rato ML,Gouveia-Oliveira A,Plancha CE.Influence of post-thaw culture on the developmental potential of human frozen embryos[J]. JAssist Reprod Genet,2012,29(8)：789-795.

[8]Guerif F,Cadoret V,Poindron J,et al.Overnight incubation improves selection of frozen-thawed blastocysts for transfer：preliminary study using supernumerary embryos[J].Theriogenology,2003,60(8)：1457-1466.

[9]李瑞岐,王文軍,麥美琪,等.慢速冷凍胚胎TET周期當天與解凍后培養(yǎng)1d移植結果分析[J].中山大學學報：醫(yī)學科學版,2011,32(6)：824-827.

[10]邢瓊,周平,章志國,等.輔助孵化與培養(yǎng)時間對凍融胚胎移植結局的影響[J].生殖醫(yī)學雜志,2007,16(1)：16-19.

[11]龔紹瓊.移植復蘇后進一步卵裂胚胎可提高凍融胚胎移植臨床妊娠率[J].現(xiàn)代醫(yī)院,2012,12(7)：11-13.

[12]程立子,吳日然,于文娟,等.體外培養(yǎng)1d對玻璃化解凍卵裂期胚胎移植效果的影響[J].中國當代醫(yī)藥,2015,22(27)：45-47,51.

[13]王寧怡,孫曉溪,陸朱娣,等.影響凍融胚胎發(fā)育潛能及妊娠結局因素的探討[J].生殖與避孕,2012,32(8)：533-539.

[14]柴三明,王琰,倪亞莉.過夜培養(yǎng)對凍融胚胎移植周期妊娠結局的影響[J].生殖與避孕,2010,30(7)：490-493.

Clinical outcome of embryo transfer in different periods and numbers after freezing and thawing.

YI Yan-hong, DONG Mei,HUANG Li.Department of Reproductive Health and Infertility,Guangdong Women and Children Hospital, Guangzhou 510010,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the clinical outcome of transfer after in different periods and numbers embryofreezing and thawing.MethodsA total of 992 transplanting cycles of D3 cleavage stage embryo on vitrification from July 2014 to July 2015 in our hospital were selected.Embryos were recovered and then cultured for 1 day before transplantation.According to the number of transplanted embryos and morula embryos,they were divided into single embryo transfer which included the non-morula group(transplanted 1 non-morula,n=41)and the morula group(transplanted 1 morula,n=28)and two embryos transfer which included the morula group M0(transplanted 2 non-morula,n=290), the morula group M1(transplanted 1 non-morula and 1 morula,n=378)and the morula group M2(transplanted 2 morula,n=255).The clinical pregnancy rate,abortion rate,ectopic pregnancy rate and premature delivery rate were analyzed.ResultsIn single embryo transfer,there was no significance in clinical pregnancy rate(28.57%vs 29.27%),miscarriage rate(5.00%vs 33.33%),ectopic pregnancy rate(0 vs 0)and preterm birth rate(12.50%vs 8.33)between the non-morula group and the non-morula group(P＞0.05),indicating the transplanted morula has nothing to do with pregnancy outcome.In two embryos transfer,the clinical pregnancy rate increased significantly(42.41%,53.17%,66.27%)with the increase of the number of transplanted morula(the morula group M0,the morula group M1 and the morula group M2)(P＜0.05).There was no significant difference in the rate of ectopic pregnancy(2.44%,3.98%,2.37%),abortion rate(11.38%,10.06%,12.94%)and preterm birth rate(19.51%,17.41%,24.26%)amongthe those groups(P＞0.05).ConclusionFor in vitro fertilization and embryo transfer,it ts recommended that D3 embryos are thawed and cultured for 1 day to morula before transplantation,which can effectively improve the clinical pregnancy rate and do not increase the risk of abortion rate,ectopic pregnancy rate and premature delivery rate.

Pregnancy;Embryo;Transplantation;Vitrification;Morula stage

R714.12

A

1003—6350（2017）14—2291—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.14.017

2016-12-07)

廣東省人口計生委科研項目（編號：20132009）

易艷紅。E-mail：yingsenchen@126.com