姚 迪,孫蕾蕾,劉 晗,侯 虎,李八方(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

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鱈魚皮明膠-Ca2+復(fù)配止血粉的止血活性研究

姚 迪,孫蕾蕾,劉 晗,侯 虎,李八方*
(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003)

利用超濾技術(shù)制備三個不同分子量段(Mr>50 ku、10 ku

鱈魚皮明膠,Ca2+,復(fù)配止血粉,止血性能

出血是導(dǎo)致創(chuàng)傷患者死亡的主要原因之一[1]。傷口處理過程中,控制出血時間,減少出血量,防止傷口與外界接觸感染,有利于患者傷口愈合和后續(xù)治療[2]。傳統(tǒng)的止血方法如止血繃帶、紗布、海綿等止血材料貼附于傷口,利用機械外力或止血材料的吸水性能阻止傷口出血,但上述止血材料在面對復(fù)雜的傷口形狀,或者傷口大面積彌漫性出血時效果欠佳。粉狀止血產(chǎn)品不受創(chuàng)面大小和部位的影響,使用方便快捷,不僅能快速有效止血,還能形成凝膠有效地保護創(chuàng)面,防止細菌的二次污染,特別適用于復(fù)雜的傷口。因此,研究者們努力尋找并開發(fā)新型粉狀止血材料是目前研究的熱點和趨勢所在。

鱈魚皮含有豐富的膠原[3],明膠作為膠原的降解產(chǎn)物,提取簡單、提取率高,且具有的無毒[4]、低抗原[5]、生物相容性[6]和生物可降解性[7]等特點備受關(guān)注,對其加工利用可以提高水產(chǎn)品的附加值。明膠目前廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等加工領(lǐng)域[8]。大量研究結(jié)果表明明膠具有優(yōu)良的止血性能,目前針對明膠止血性能的研究主要集中在醫(yī)用止血海綿,如明膠殼聚糖止血海綿[9],對不同分子量段明膠基復(fù)配止血粉的研究較少。鈣離子作為凝血因子之一,參與凝血過程[10]。將明膠與鈣離子復(fù)配,以發(fā)揮材料之間的協(xié)同效應(yīng)。

本研究采用超濾技術(shù)得到高分子量(Mr>50 ku)、中分子量(10 ku

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鱈魚皮明膠 由山東東方海洋科技股份有限公司提供;Wistar大鼠 SPF級,雄性,180～220 g,北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2012-0001;活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(Prothrombin Time,PT)、大鼠 PF4、P-選擇素和TXB2試劑盒 南京建成生物工程研究所;氯化鈣、烏來糖及其他試劑 均為分析純。

Alphal-4LD型冷凍干燥機 德國Christ公司;Hitachi835-50型超濾杯、超濾膜 上海摩速科學(xué)儀器有限公司;2-16KL型冷凍離心機 Sigma公司;SL-318型半自動凝血儀 濟南森藍科貿(mào)有限公司;Power Wave XS2型酶標儀 基因有限公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同分子量鱈魚皮明膠的制備 蒸餾水配制濃度為2%(w/v)的鱈魚皮明膠溶液,雙層濾紙過濾,0.2 MPa 氮氣加壓下,用截留分子量為10、50 ku 的超濾膜依次超濾處理,得到高分子量(Mr>50 ku)、中分子量(10 ku

1.2.2 不同分子量鱈魚皮明膠-Ca2+復(fù)配止血粉的制備 調(diào)節(jié)三個分子量段和未分離分子量鱈魚皮明膠溶液 pH為 5.5,按明膠:氯化鈣為9∶1(W/W)添加氯化鈣固體試劑,攪拌均勻,混合溶液在50 ℃水浴反應(yīng) 1 h。反應(yīng)結(jié)束經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥、超微粉碎和紫外消毒得到高分子量(Mr>50 ku)、中分子量(10 ku

1.2.3 復(fù)合止血粉液體吸收倍率的測定

1.2.3.1 模擬體液(SBF)的配制 精確稱取NaCl 8.035 g、NaHCO30.355 g、KCl 0.255 g、K2HPO4·3H2O 0.231 g、MgCl2·6H2O 0.311 g、1 mol/L HCl 39 mL、CaCl20.292 g 和Na2SO40.072 g,按照以上順序配制成1 L溶液,并用Tris調(diào)節(jié)pH為7.25,在37 ℃下備用。

1.2.3.2 測定方法 選用生理鹽水(NS)、模擬體液(SBF)和枸櫞酸鹽抗凝全血(WB)三種溶液分別測定四種分子量段的鱈魚皮明膠-Ca2+復(fù)配止血粉的液體吸收倍率。精確稱量0.5 g的各組樣品,記為Wdry,用濾紙包好,將濾紙包分別同時放入NS、SBF和WB三種溶液中,5 min 后將濾紙包從三種溶液中同時拿出,分別稱重,依次記為Wwet-N、Wwet-S和Wwet-W。同等重量的空白濾紙重復(fù)上述步驟,記為W濾紙。各組樣品在三種溶液中的液體吸收倍率按照公式計算[11]:

1.2.4 體外凝血實驗 參考張姝妹等[12]報道方法略有改動。分別準確稱取 20 mg 四種分子量段的鱈魚皮明膠-Ca2+復(fù)配止血粉于潔凈試管中,在37 ℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱30 min。采用3.8%枸緣酸鈉真空采血管對大鼠腹主動脈取血,每個試管加入0.5 mL的血液。每隔10 s 將試管傾斜約30度觀察血液流動情況,當試管中的血液全凝后,停止計時,記下該組的凝血時間。每組測定三個平行,以生理鹽水為陰性對照。

1.2.5 大鼠股動脈和肝創(chuàng)面實驗 大鼠股動脈和肝創(chuàng)面的止血方法參照張姝妹等[12]報道方法略有改動。選取體重 200 g 左右的健康 Wistar 雄性大鼠 40 只,隨機分為5組,每組8只,分別為高分子量、中分子量、低分子量、未分段明膠-Ca2+復(fù)配止血粉組和醫(yī)用紗布組。用30%的烏來糖(氨基甲酸乙酯)進行大鼠腹腔注射麻醉,注射劑量為1 g/kg體重。

1.2.5.1 大鼠股動脈止血實驗 大鼠股內(nèi)側(cè)切一縱向切口,暴露出完整股動脈,使用消毒后的手術(shù)剪在大鼠股動脈剪開直徑約為0.3 cm的切口。普通紗布擦去涌出的血液后,迅速將200 mg紫外消毒后的復(fù)配止血粉均勻撒在切口上,同時開啟秒表計時,精確稱量的無菌紗布每隔20 s 蘸取滲血,直至無菌紗布無法蘸取到滲血時停止秒表,記為股動脈出血時間。對照組直接用無菌紗布覆蓋。出血量為無菌紗布實驗前后的重量差[12]。

1.2.5.2 大鼠肝創(chuàng)面止血實驗 大鼠剪去腹毛，逐層剝開腹腔，普通紗布快速擦去腹腔與腹壁上的血液和組織液，暴露出大鼠完整肝臟中葉，使用消毒后的手術(shù)剪在肝中葉處作長約1 cm，深約0.5 mm的創(chuàng)面，迅速將50 mg紫外消毒后的止血粉撒在切口上,同時計時,精確稱量的無菌紗布每隔20 s蘸取滲血,直至無菌紗布無法蘸取到滲血時停止計時。對照組直接用普通紗布覆蓋。出血量為無菌紗布實驗前后的重量差[12]。

1.2.6 活化部分凝血活酶時間(APTT)和凝血酶原時間(PT)測定 用生理鹽水配制5 mg/mL的高分子量(Mr>50 ku)和中分子量(10 ku

1.2.7 血小板聚集實驗 生理鹽水配制1 mg/mL的高分子量組(Mr>50 ku)和中分子量組(10 ku

1.2.8 血小板第四因子(PF4)、P-選擇素、血栓烷素B2(TXB2)測定 用生理鹽水配制1 mg/mL的高分子量組(Mr>50 ku)和中分子量組(10 ku

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子量鱈魚皮明膠-Ca2+復(fù)配止血粉的液體吸收性能測定

止血粉的液體吸收倍率是評價止血性能的一項重要指標[12]。止血粉的液體吸收速率越快、吸收量越大,越能在傷口出血時快速吸收血液,使血液中的血小板和凝血因子濃縮,加快止血。同時止血材料吸水膨脹也有助于堵塞傷口,是重要的物理止血途徑之一[13]。如圖1所示明膠-Ca2+復(fù)配止血粉的吸水倍率隨著明膠分子量的升高而增大,高分子量組(Mr>50 ku)的液體吸收倍率最大,其次是未分離分子量組,低分子量組(Mr<10 ku)的液體吸收性能最差。

圖1 不同分子量明膠-Ca2+復(fù)配止血粉的液體吸收性能Fig.1 The absorbance of liquids of different molecular weight gelatin-Ca2+ compound hemostatic powder注:“NS”代表生理鹽水,“SBF”代表模擬體液,“WB”代表全血,含有不同字母的每組數(shù)據(jù)差異顯著(p<0.05)。

2.2 不同分子量鱈魚皮明膠-Ca2+復(fù)配止血粉對體外凝血時間的影響

體外凝血時間是評價止血類產(chǎn)品體外凝血性能的一項重要指標。如圖2所示,明膠-Ca2+復(fù)配止血粉組與生理鹽水組相比,體外凝血時間縮短,高分子量明膠-Ca2+復(fù)配止血粉的凝血時間最短(p<0.05),平均為(24±8)s,凝血效果最好。未分離分子量組和中分子量組差異不大(p>0.05),原因可能是未分離分子量組的分子量相對集中在10～50 ku之間和中分子量組的分子量分布相似。隨著明膠分子量的繼續(xù)降低,凝血時間延長,明膠-Ca2+復(fù)配止血粉的體外凝血效果逐漸減弱。低分子量組的體外凝血時間在100 s以上,與對照組相比,沒有顯著性差異(p>0.05)。

圖2 不同分子量明膠-Ca2+復(fù)配止血粉對體外凝血時間的影響Fig.2 Effect of different molecular weight gelatin-Ca2+compound hemostatic powder on coagulation time in vitro注:與生理鹽水組相比,*p<0.05,**p<0.01。

2.3 大鼠股動脈和肝創(chuàng)面實驗結(jié)果

2.3.1 不同分子量鱈魚皮明膠-Ca2+復(fù)配止血粉對大鼠股動脈止血效果的影響 如圖3A和B所示,高分子量組明膠-Ca2+復(fù)配止血粉的出血時間為(114±36) s,止血時間最短,出血量為(0.71±0.18) g,出血量最少,止血效果最好。研究結(jié)果與張姝妹等[12]的大鼠股動脈實驗結(jié)果相比,出血時間縮短了32 s,原因可能是復(fù)合止血粉中引入Ca2+的結(jié)果,Ca2+作為凝血因子之一,具有促進凝血的作用。其次是未分離分子量的明膠-Ca2+復(fù)配止血粉,出血時間為(145±24) s,出血量為(0.93±0.17) g。隨著分子量的降低,股動脈出血時間延長,出血量增加,說明明膠-Ca2+復(fù)配止血粉的股動脈止血效果隨著明膠分子量的下降而降低。低分子量組與醫(yī)用紗布對照組相比,沒有顯著性差異(p>0.05),說明低分子量組對股動脈止血沒有明顯作用。高分子量的明膠-Ca2+復(fù)配止血粉吸水性強,容易使血小板凝聚從而加速止血。

2.3.2 不同分子量鱈魚皮明膠-Ca2+復(fù)配止血粉對大鼠肝創(chuàng)面止血效果的影響 不同分子量鱈魚皮明膠鈣樣品的大鼠肝創(chuàng)面出血時間和出血量實驗結(jié)果如圖3A和B所示。高分子量組(Mr>50 ku)明膠-Ca2+復(fù)配止血粉的出血時間最短,平均為(97±25) s,出血量最少,平均為(0.42±0.19) g,止血效果最好,隨著分子量的下降,肝創(chuàng)面出血時間逐漸延長,出血量逐漸增加,止血效果降低。低分子量組對肝創(chuàng)面止血沒有明顯作用,這一結(jié)果與大鼠股動脈止血實驗相符結(jié)合。結(jié)合上述止血活性實驗結(jié)果,由于低分子量明膠-Ca2+復(fù)配止血粉對大鼠體內(nèi)、外止血均沒有顯著作用,故只對中高分子量組做止血機理性研究。

圖3 不同分子量明膠-Ca2+復(fù)配止血粉對大鼠股動脈和肝創(chuàng)面止血的影響Fig.3 Effect of different molecular weight gelatin-Ca2+ compound hemostatic powder on femoral artery cutting and liver cutting experiments 注:與醫(yī)用紗布組相比,*p<0.05,**p<0.01。

2.4 不同分子量鱈魚皮明膠-Ca2+復(fù)配止血粉對APTT和PT的影響

圖4 不同分子量明膠-Ca2+復(fù)配止血粉對APTT和PT的影響Fig.4 Effect of different molecular weight gelatin-Ca2+compound hemostatic powder on APTT and PT注:與生理鹽水組相比,*p<0.05,**p<0.01;圖5、圖6同。

凝血途徑主要可以分為內(nèi)源性凝血途徑、外源性凝血途徑和凝血共同途徑[16]。APTT變化主要表征內(nèi)源性凝血途徑,PT變化主要表征外源性凝血途徑[17]。如圖4所示,中、高分子量明膠-Ca2+復(fù)配止血粉組與生理鹽水組相比,APTT時間明顯縮短,高分子量明膠-Ca2+復(fù)配止血粉組APTT時間最短,而PT 差異不大,這與張姝妹等[11]的研究結(jié)果一致,說明明膠-Ca2+復(fù)配止血粉主要對內(nèi)源性凝血途徑起作用，通過縮短凝血活酶時間來加速止血。

2.5 不同分子量鱈魚皮明膠-Ca2+復(fù)配止血粉對血小板聚集的影響

在富血小板血漿加入ADP血小板聚集誘導(dǎo)劑可以促進血小板聚集,血小板聚集率隨著吸光度值的增加而增大[18]。如圖5所示,與生理鹽水組相比,中、高分子量明膠-Ca2+復(fù)配止血粉組的吸光度值顯著增加(p<0.05),說明明膠-Ca2+復(fù)配止血粉可以通過促進血小板聚集促進血栓生成加速止血,高分子量明膠-Ca2+復(fù)配止血粉組血小板聚集率最高,但顯著低于 ADP處理組。

圖5 不同分子量明膠-Ca2+復(fù)配止血粉對血小板聚集的影響Fig.5 Effect of different molecular weight gelatin-Ca2+compound hemostatic powder on platelet aggregation

2.6 不同分子量鱈魚皮明膠-Ca2+復(fù)配止血粉對PF4、P-選擇素和TXB2的影響

圖6 不同分子量明膠-Ca2+復(fù)配止血粉對血小板釋放活性因子的影響Fig.6 Effect of different molecular weight gelatin-Ca2+ compound hemostatic powder on the release of platelet active factors

在止血過程中,血小板被激活后釋放一系列活性因子促進血栓形成[19]。血小板第四因子(PF4)是由血小板α顆粒合成的一種特異蛋白質(zhì),能夠減慢凝血酶滅活過程,促進血栓形成。P-選擇素主要介導(dǎo)粒細胞和單核細胞與血小板的黏附。血栓烷 A2(TXA2)是一種血栓素,常用作血管收縮劑,可以促進血小板聚集,TXA2 釋放后會很快轉(zhuǎn)變?yōu)?TXB2[20]。血漿中血小板釋放活性因子含量越高,說明止血效果越好。如圖6所示,與生理鹽水組相比,高分子量組和中分子量組的明膠-Ca2+復(fù)配止血粉處理血漿中血小板釋放活性因子 PF4、P-選擇素和 TXB2 的含量均有顯著增加(p<0.05),其中高分子量明膠-Ca2+復(fù)配止血粉組PF4、P-選擇素和 TXB2含量最高,說明高分子量明膠-Ca2+復(fù)配止血粉通過促進大鼠血小板活性因子的釋放來縮短凝血時間。這與血小板聚集實驗結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

液體吸收倍率實驗中,明膠-Ca2+復(fù)配止血粉的吸水倍率隨著明膠分子量的升高而增大,高分子量組的明膠-Ca2+復(fù)配止血粉的吸水倍率最大。大鼠體外凝血、股動脈出血和肝創(chuàng)面出血的實驗結(jié)果可以看出,明膠-Ca2+復(fù)配止血粉對體、內(nèi)外止血具有一定的效果。與自然止血組相比,樣品組可以明顯縮短出血時間,減少出血量。明膠-Ca2+復(fù)配止血粉的止血效果與明膠分子量有關(guān),三組實驗均可以證明中、高分子量明膠-Ca2+復(fù)配止血粉組的止血效果要明顯高于低分子量組。通過對中、高分子量明膠-Ca2+復(fù)配止血粉止血機理研究發(fā)現(xiàn),明膠-Ca2+復(fù)配止血粉可以縮短 APTT 時間,主要作用于內(nèi)源性凝血途徑。高分子量明膠-Ca2+復(fù)配止血粉的血小板的聚集效果最明顯,且能顯著促進血小板活性因子 PF4、P-選擇素和 TXB2 的釋放來促進止血。這一結(jié)果為高分子量明膠-Ca2+復(fù)配止血粉作為止血產(chǎn)品的研究提供了依據(jù)。

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Hemostatic activity of cod skin gelatin-Ca2+complex hemostatic powder

YAO Di,SUN Lei-lei,LIU Han,HOU Hu,LI Ba-fang*

(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Three cod skin-derived gelatin with different molecular weights(Mr>50 ku,10 ku

cod skin gelatin;Ca2+;compound hemostatic powder;hemostatic properties

2016-12-20

姚迪(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品加工與功能食品，E-mail:18765939602@163.com。

*通訊作者:李八方(1953-)，男，博士，教授，研究方向：海洋活性物質(zhì)與功能性食品，E-mail:bfli@ouc.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金面上項目 (31471606) ；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目 (31401476)。

TS254.1

A

1002-0306(2017)14-0035-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.008