羅 敏,陳德經,蘇 文(.陜西理工大學,生物科學與工程學院,陜西漢中 72300; 2.陜西理工大學,陜西省資源生物重點實驗室,陜西漢中 72300)

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大米胚芽鋅多糖制備及其抗氧化活性

羅 敏1,陳德經2,*,蘇 文1
(1.陜西理工大學,生物科學與工程學院,陜西漢中 723001; 2.陜西理工大學,陜西省資源生物重點實驗室,陜西漢中 723001)

采用超聲輔助提取大米胚芽多糖,并以多糖和硫酸鋅為原料制備大米胚芽鋅多糖絡合物并研究其活性。結果表明，大米胚芽鋅多糖適宜的制備工藝條件為:多糖與硫酸鋅質量比(1.000∶0.800)、溶液pH為6.0、反應溫度65 ℃、反應時間2.5 h。在此條件下,所制備的鋅多糖配合物中鋅元素含量為(5.617±0.279) mg/g。此外大米胚芽多糖、大米胚芽鋅多糖對DPPH自由基清除率為57.76%、62.15%;對超氧陰離子自由基的清除率為60.11%、67.44%;對羥自由基清除率為56.94%、61.89%;對還原力隨濃度的增加而增強?？梢?大米胚芽鋅多糖比大米胚芽多糖的抗氧化活性更強。

大米胚芽,多糖,鋅多糖,抗氧化活性

米胚是稻谷加工大米的副產物,約占稻谷總質量的2%至2.2%[1],是整個稻谷籽粒中的精華,并具有顯著的營養(yǎng)價值。米胚中營養(yǎng)成分含量豐富,蛋白質和脂類的含量分別為22.25%和26.44%,多糖的含量高達27.31%[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn),多糖具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、調節(jié)免疫力、降血糖、抗糖尿病等功效[3-4]。

鋅是人體中必須的微量元素之一[5]。成年人組織中總鋅含量為2～2.5 g,我國成年人鋅的推薦量為11～12 mg,至少有85種酶是含鋅的金屬酶,因此鋅幾乎與所有水平上的蛋白質和氨基酸代謝有關[6]。鋅還具有與巰基的親和力,而巰基是決定蛋白質結構(例如酶、膜)的重要因素。鋅起著特殊作用的酶包括乙醇脫氫酶、超氧化物歧化酶、谷氨酸脫羧酶等。鑒于鋅參與生物體系幾乎所有的代謝,包括遺傳物質的轉錄和復制,因此,鋅缺乏癥狀是非特異性的,可能有許多病癥同時出現(xiàn)[7]。鋅可增強兒童生長發(fā)育,提高人體免疫力,預防疾病等[8]。人體獲得鋅主要依賴于食物,常見的補鋅制劑多為無機鋅,不僅不利于吸收,劑量過多時對人體有毒害作用[9]。隨著科學研究進展,發(fā)現(xiàn)有機鋅可增強生物吸收及利用,因此有機鋅化合物的合成成為科研人員的研究熱點。目前合成的多糖鋅有蛹蟲草基質多糖鋅[7]、酵母多糖鋅、金針菇多糖鋅[10-11]等,其采用的合成方法主要有食用菌液體發(fā)酵富集鋅,人工合成法[12-13]。國內外研究報道鋅多糖具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂、降血糖等生物活性[14-15],而對米胚鋅多糖的制備及活性尚未研究報道。

本實驗利用多糖與硫酸鋅制備出一種補鋅保健產品,并研究其體外抗氧化活性,意在開發(fā)具有不同的新型多糖與微量元素螯合物的研究奠定理論基礎,同時增加大米胚芽多糖的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米胚芽 勉縣定軍米業(yè)發(fā)展有限責任公司(秈米);石油醚、正丁醇、蒽酮、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯化鐵、三氯乙酸等 均為分析純;優(yōu)級純硝酸、鋅標準溶液(1.000 mg/mL) 天津市光復精細化工研究所。

DK-98-Ⅱ型恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;JA5003型電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;LC-800型低速臺式離心機 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;DZF-6050型真空干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;SB-3200型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;RV10型基本型數(shù)顯型旋轉蒸發(fā)儀 廣州儀科實驗室技術有限公司;UV-1750型紫外可見分光光度儀 日本島津儀器公司;Thermo SOLAAR MKII M6原子吸收分光光度計 Thermo Electron corporation。

1.2 實驗方法

1.2.1 大米胚芽多糖的提取 取一定質量干燥的大米胚芽,加3倍體積的石油醚溶液在70 ℃下回流脫脂3 h,冷卻后3800 r/min離心10 min,取殘渣于60 ℃恒溫鼓風干燥箱中烘干。稱取脫脂后烘干的大米胚芽200 g,加入2000 mL蒸餾水,65 ℃水浴提取3 h,80 W超聲波10 min,冷卻至室溫離心(3800 r/min,10 min),取上清液,殘渣用蒸餾水再浸提2次,合并3次上清液,濃縮上清液至原體積的1/3后加入3倍體積的Sevage溶液(氯仿∶正丁醇=3∶1),劇烈振搖15 min,離心(3800 r/min,10 min),取上清液,棄去變性蛋白,將上清液重復除變性蛋白的操作,直至中間層無變性蛋白。向上清液中加入95%乙醇,乙醇的最終體積分數(shù)為85%,冰箱冷藏,靜置12 h后,3800 r/min離心10 min,沉淀用乙醇丙酮洗滌3次,50 ℃真空干燥24 h(0.08 mPa),得大米胚芽粗多糖[16]。多糖的提取率公式為:

式中:A為干燥后多糖的質量(g);B為脫脂的大米胚芽質量(g);K為多糖提取率(%)。

1.2.2 去除陽離子大米胚芽多糖 采用戴強[17]的方法預處理好陽離子樹脂,將浸泡好的凝膠緩慢勻速倒入柱中以防止氣泡產生,自然沉降,取上述制得的多糖溶解成1%的多糖溶液,溶液上柱,上樣量為600 mm×55 mm柱體積的20%,控制流速為1.0 mL/min。用去離子水洗脫,洗脫液濃縮至原體積的1/3后,加入95%乙醇,乙醇的最終體積分數(shù)為85%,之后離心、干燥與1.2.1步驟相同,得去除陽離子大米胚芽多糖。

1.2.3 多糖含量測定 用硫酸-蒽酮法測定大米胚芽粗多糖中多糖含量。

1.2.3.1 葡萄糖標準曲線的建立 準確稱取0.1000 g分析純葡萄糖(預先在105 ℃干燥至恒重),配制成溶液濃度分別為10、30、50、70、90 μg/mL葡萄糖標準液。分別取不同濃度的葡萄糖標準液2 mL于試管中,以蒸餾水作空白,分別加入8 mL硫酸蒽酮溶液(2 mg/mL),迅速浸入冰水浴中,放置在100 ℃沸水浴中10 min取出,流法水冷卻,在625 nm處測定吸光度[18],以吸光度值(Y)為縱坐標,葡萄糖濃度(X,μg/mL)為橫坐標,繪制標準曲線圖,其標準曲線方程為:Y=0.0056X+0.0412,R2=0.9989。

1.2.3.2 樣品的測定 準確移取配制50 μg/mL米胚多糖溶液2 mL,按1.2.3.1方法顯色,測其吸光度,并計算樣品多糖的含量。

1.2.4 大米胚芽鋅多糖的制備 稱取1.000 g的大米胚芽多糖溶于150 mL去離子水中,配制成大米胚芽粉多糖溶液,緩慢加入0.800 g的ZnSO4·7H2O溶液,調節(jié)溶液pH,置于一定溫度水浴攪拌反應一定時間[10,19]。反應完畢后,65 ℃濃縮至原體積的1/3,冷卻后加入4倍體積的95%乙醇沉淀,4 ℃靜止24 h,離心(4000 r/min,10 min)所得沉淀用少量去離子水溶解后用蒸餾水透析24 h,透析產物用95%乙醇醇析得沉淀物,50 ℃真空干燥得鋅多糖。

1.2.4.1 單因素實驗 硫酸鋅添加量對鋅多糖制備的影響:設定pH為6,反應溫度為70 ℃,反應時間為2 h,以多糖與硫酸鋅質量比分別為1.000∶0.200、1.000∶0.400、1.000∶0.600、1.000∶0.800、1.000∶1.000制備鋅多糖,考察硫酸鋅添加量對鋅含量的影響。

pH對鋅多糖制備的影響:設定多糖與硫酸鋅質量比為1.000∶0.800,反應溫度為70 ℃,反應時間為2 h,反應pH分別為4、5、6、7、8制備鋅多糖,考察pH對鋅含量的影響。

反應溫度對鋅多糖制備的影響:設定多糖與硫酸鋅質量比為1.000∶0.800,反應pH為6,反應時間為2 h,反應溫度分別為55、60、65、70、75 ℃制備鋅多糖,考察反應溫度對鋅含量的影響。

反應時間對鋅多糖制備的影響:設定多糖與硫酸鋅質量比為1.000∶0.800,反應pH為6,反應溫度為65 ℃,反應時間分別為1、2、3、4、5 h制備鋅多糖,考察反應時間對鋅含量的影響。

1.2.4.2 正交實驗 根據單因素實驗,選取硫酸鋅添加量、溶液pH、反應時間、反應溫度4個因素進行正交優(yōu)化實驗,以期得到大米胚芽鋅多糖制備的最優(yōu)工藝,以鋅含量為指標,正交實驗因素水平見表1。

表1 大米胚芽鋅多糖正交實驗設計因素水平Table 1 Design and factors of orthogonal experiment for zinc polysaccharide in rice germplasm

1.2.4.3 大米胚芽鋅多糖配合物中鋅元素的測定 鋅標準曲線測定:精密配制濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L的鋅標準溶液,利用原子吸收分光光度計測定,檢測波長213.9 nm,通帶1.0 nm,燈電流75%。測得的標準曲線方程為:Y=0.16841X+0.0109,R2=0.9966。式中:Y為吸光度;X為鋅離子濃度(mg/L)。

樣品的處理及鋅離子含量的測定:稱取0.100 g左右的大米胚芽鋅多糖于消解罐中,加入6 mL優(yōu)級純硝酸,2 mL H2O2溶液,使用微波消解儀進行消解樣品,最后用超純水定容至50 mL比色管,搖勻,利用原子吸收分光光度計分別測定其吸光度,其測定條件與標準溶液測定相同,根據鋅離子標準曲線計算鋅含量,進而利用下列公式計算配合物中鋅元素含量。

式中:X-樣品中鋅元素的含量(mg/g);A-樣品中鋅的質量濃度(mg/L);F-溶液稀釋倍數(shù);V-溶劑體積(mL);M-樣品質量(g)。

1.2.5 大米胚芽多糖和大米胚芽鋅多糖的結構表征 對產物在190～800 nm波長下進行紫外分析,確定其為目標產物。

1.2.6 抗氧化性測定

1.2.6.1 DPPH·清除實驗 將多糖與鋅多糖的樣品溶液(1 mg/mL)用蒸餾水稀釋至0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mg/mL,分別取稀釋后樣品溶液3 mL加入0.2 mmol/L DPPH無水乙醇溶液3 mL于試管中,混勻后避光靜置30 min,以蒸餾水代替樣品做空白組,在517 nm處測定吸光值,做三組平行樣[20]。按照下式計算清除率。

式中:A0:空白組的吸光度;A:樣品溶液的吸光度。

式中:A0:空白組的吸光度;A:樣品溶液的吸光度。

1.2.6.3 ·OH清除實驗 將1 mg/mL的樣品溶液用蒸餾水分別稀釋為0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mg/mL的待測物溶液,分別取2 mL上述待測物溶液于試管中,依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL、6 mmol/L水楊酸乙醇溶液2 mL,最后加入8 mmol/L的H2O2溶液2 mL以啟動反應,37 ℃水浴加熱30 min后終止反應,蒸餾水做空白對照,于510 nm測定吸光度,做三組平行樣[22]。按照下式計算清除率。

式中:A0:空白組的吸光度;A:樣品溶液的吸光度。

1.2.6.4 總還原力測定 參照文獻[23]的方法,略作修改。將1 mg/mL的樣品溶液用蒸餾水稀釋成質量濃度為0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mg/mL的溶液。分別取1 mL上述溶液于試管中,依次加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L)和2.5 mL體積分數(shù)1%的鐵氰化鉀溶液,混勻,在50 ℃保溫20 min后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸終止反應,混合后以3000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL,加蒸餾水2.5 mL和0.5 mL 0.1%的FeCl3,靜置10 min,在700 nm 波長處測定吸光度,做三組平行樣。

1.3 數(shù)據處理

采用Excel軟件進行數(shù)據統(tǒng)計分析并作圖,且所有實驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 大米胚芽多糖提取率和多糖含量

采用超聲法輔助提取大米胚芽多糖,其多糖提取率為16.24%;根據葡萄糖標準曲線測得去除陽離子的大米胚芽多糖含量為76.42%。

2.2 大米胚芽鋅多糖制備實驗

2.2.1 多糖與硫酸鋅質量比對鋅多糖制備的影響 由圖1可知,多糖與硫酸鋅質量比增加時,鋅含量隨之增加,當質量比(1.000∶0.800)進一步增加時,鋅含量卻隨之下降,是因為鋅離子濃度越大,會增加米胚多糖與金屬離子之間的靜電作用,從而降低鋅含量[10]。故選擇多糖與硫酸鋅質量比為(1.000∶0.800)時,鋅多糖中鋅含量最高。

圖1 多糖與硫酸鋅質量比對配合物反應的影響Fig.1 The effect of the ratio of polysaccharide and zinc sulfate on the reaction of complexes

2.2.2 pH對鋅多糖制備的影響 由圖2可知,隨著pH增大鋅含量也隨著增大,當pH增加到6之后鋅含量隨之減少,主要是因為鋅離子與OH-優(yōu)先結合生成沉淀,從而影響鋅多糖中鋅含量。這與陳平[13]研究的食用菌中多糖與鋅離子配合工藝優(yōu)化中不同pH對鋅含量有不同的影響結論相似。故選擇pH為6時,鋅多糖中鋅含量最高。

圖2 pH對配合物反應的影響Fig.2 Effect of pH on the reaction of complexes

2.2.3 反應溫度對鋅多糖制備的影響 由圖3可知,反應溫度會影響分子之間的運動,隨著溫度的升高,鋅含量先增大后減少,當溫度大于65 ℃時，鋅含量急劇下降，不適合體系的反應。故選擇反應溫度為65 ℃,鋅多糖中鋅含量最高。

圖3 溫度對配合物反應的影響Fig.3 Effect of temperature on the reaction of complexes

2.2.4 反應時間對鋅多糖制備的影響 由圖4可知,反應時間對鋅含量影響較小,當反應時間為3 h時,鋅含量達到最大,之后逐漸減小,是因為配合物逐漸開始解離,使鋅多糖中鋅含量減少。

圖4 反應時間對配合物反應的影響Fig.4 Effect of reaction time on the reaction of complexes

2.3 大米胚芽鋅多糖制備的正交實驗優(yōu)化結果

通過表3可以直觀的看出,以鋅含量為指標,各因素對大米胚芽鋅多糖制備的影響順序為:A>B>D>C,即:硫酸鋅添加量>溶液pH>反應時間>反應溫度。最佳合成工藝為:A2B2C3D1,即多糖與硫酸鋅質量比(1.000∶0.800)、溶液pH為6、反應溫度65 ℃、反應時間2.5 h,所得鋅含量為5.594 mg/g。

表3 大米胚芽鋅多糖正交實驗優(yōu)化結果Table 3 Orthogonal test optimization of zinc polysaccharide in rice germ

2.4 驗證性實驗

稱取3份多糖各1.000 g置于燒杯中,使用正交實驗所得最適宜的條件進行鋅多糖的制備,按照1.2.4.3的實驗方法對鋅多糖中鋅的含量進行測定,3次重復取平均值后測得鋅多糖配合物中含有(5.617±0.279) mg/g的鋅元素,接近于正交實驗所得的值5.594 mg/g。

2.5 大米胚芽多糖和大米胚芽鋅多糖紫外圖譜

從圖5和圖6可知,大米胚芽多糖和大米胚芽鋅多糖的紫外光譜在260 nm和280 nm附近均無明顯特征吸收峰,可能是核酸和蛋白質含量很低的緣故。而大米胚芽鋅多糖在200 nm處出現(xiàn)明顯的特征吸收峰,存在明顯的差異,峰值的變化說明大米胚芽多糖結構發(fā)生了變化,由此推測大米胚芽多糖中成功的引入鋅離子。

圖5 大米胚芽多糖紫外吸收光譜圖Fig.5 Ultraviolet absorption spectra of rice germ polysaccharides

圖6 大米胚芽鋅多糖紫外吸收光譜圖Fig.6 Ultraviolet absorption spectra of rice germ zinc polysaccharide

2.6 抗氧化性測定結果

2.6.1 DPPH·清除實驗結果 在實驗設置的濃度范圍內,隨著多糖和鋅多糖濃度的增加,對DPPH自由基的清除率也逐漸增加,均表現(xiàn)出量效關系,但清除作用均小于VC。當濃度為1.8 mg/mL時,大米胚芽鋅多糖、大米胚芽多糖對DPPH自由基的清除率分別為62.15%、57.76%,其IC50值分別為0.94、1.14 mg/mL,而VC在濃度1 mg/mL時清除率達到94%以上,如圖7所示。

圖7 大米胚芽多糖和鋅多糖對DPPH·清除效果Fig.7 Effects of rice germ polysaccharide and zinc polysaccharide on DPPH· removal

圖8 大米胚芽多糖和鋅多糖對清除效果Fig.8 Effect of rice germ polysaccharide and zinc polysaccharide on ·scavenging

2.6.3 ·OH清除實驗結果 大米胚芽多糖和大米胚芽鋅多糖隨濃度的增加,對·OH自由基的清除率也在逐漸增加,均表現(xiàn)出量效關系。當濃度為1.8 mg/mL時,大米胚芽鋅多糖、大米胚芽多糖對·OH自由基的清除率分別為61.89%、56.94%,均低于VC,其IC50值分別為0.71、0.91 mg/mL,當濃度為1.0 mg/mL時,兩者對羥自由基的清除能力趨于平緩,VC的清除率達到96%以上,可見大米胚芽鋅多糖和大米胚芽多糖的清除率與VC的羥自由基清除能力差異較大,見圖9。

圖9 大米胚芽多糖和鋅多糖對·OH清除效果Fig.9 Effect of rice germ polysaccharide and zinc polysaccharide on · OH removal

2.6.4 總還原力測定結果 大米胚芽多糖、大米胚芽鋅多糖均具有一定的還原力,在實驗設置的濃度范圍內,隨著質量濃度的增加,其還原力也增加,見圖10所示。

圖10 大米胚芽多糖和鋅多糖的總還原力Fig.10 The total reducing power of rice germ polysaccharide and zinc polysaccharide

3 結論

以鋅含量為指標,采用L9(34)正交設計優(yōu)化大米胚芽鋅多糖的制備工藝,確定適宜合成工藝為:多糖與硫酸鋅質量比(1.000∶0.800)、溶液pH為6、反應溫度65 ℃、反應時間2.5 h。在此條件下重復3次實驗,測得大米胚芽鋅多糖中含有(5.617±0.279) mg/g的鋅元素。

大米胚芽多糖和大米胚芽鋅多糖的抗氧化實驗表明,在實驗設置的濃度范圍內,隨著濃度的增加,大米胚芽鋅多糖對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除能力也逐漸增強且均強于大米胚芽多糖,其還原力也強于大米胚芽多糖。實驗可為大米胚芽多糖、大米胚芽鋅多糖開發(fā)功能性保健食品或藥品提供理論基礎。

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Preparation and antioxidant activity of rice germ Zn2+-polysaccharide

LUO Min1,CHEN De-jing2,*,SU Wen1

(1.School of Biological Science and Engineering,Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723001,China; 2.Provincial Bio-resource Key Laboratory,Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723001,China)

The polysaccharide was extracted from rice germ The polysaccharide complex of rice germ zinc was prepared with polysaccharide and zinc sulfate as raw materials and its activity was studied. The results showed that the optimum preparation conditions were as follows:the mass ratio of polysaccharide to zinc sulfate(1.000∶0.800),the pH value of the solution was 6.0,the reaction temperature was 65 ℃,and the reaction time was 2.5 h. Under these conditions,the content of zinc in the zinc polysaccharide complex was(5.617±0.279) mg/g. In addition,the scavenging rate of DPPH free radicals was 57.76% and 62.15% respectively. The scavenging rate of superoxide anion radical was 60.11% and 67.44% respectively. The scavenging rate of hydroxyl radical was 56.94% and 61.89%. The reduction force increases with increasing concentration. It could be seen that the polysaccharide of rice germ had more antioxidant activity than rice germ polysaccharide.

rice germ poly-saccharide;polysaccharide;Zn polysaccharides;antioxidant activity

2016-12-20

羅敏(1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：食品生物化學，E-mail:1053378593@qq.com。

*通訊作者:陳德經(1961-)，男，碩士，教授，研究方向：食品生物技術，E-mail:cdjslg@126.com。

陜西省農業(yè)攻關項目(2015NY012)；漢中市漢臺區(qū)科學技術計劃項目(2014JX1-22)。

TS210.1

B

1002-0306(2017)14-0238-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.046