段會勇

（泰山職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)工程系，山東 泰安 271000）

疾病防控

兔舍內(nèi)氣載革蘭氏陰性菌群的檢測

段會勇

（泰山職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)工程系，山東 泰安 271000）

采用ANDERSEN-6級空氣微生物樣品收集器，以5%公綿羊血瓊脂和麥康凱3號培養(yǎng)基為采樣介質(zhì)，分別對3個不同兔場環(huán)境中氣載需氧菌含量、氣載革蘭氏陰性菌含量與菌群組成進行了檢測。結(jié)果表明：兔舍內(nèi)氣載需氧菌含量在0.78×103～20.10×103CFU/m3之間，氣載需氧革蘭氏陰性菌含量在0.39×102～10.30×102CFU/m3之間，占需氧菌總數(shù)的2.12%～10.20%；革蘭氏陰性菌群包括腸桿菌、奈瑟氏菌、巴氏桿菌和假單胞菌，腸桿菌科細菌中大腸埃希氏菌占多數(shù)。在其中2個兔舍中還檢測到可導(dǎo)致兔發(fā)生肺炎的肺炎克雷伯氏菌。

兔舍；氣載革蘭氏陰性菌；微生物氣溶膠

隨著集約化、規(guī)?；竽辽a(chǎn)的發(fā)展和養(yǎng)殖經(jīng)驗的積累，人們已經(jīng)越來越深入地認識到微生物氣溶膠在流行病傳播中所占的重要地位。畜禽主要烈性傳染病大都通過氣源性傳播，給畜牧業(yè)造成極大的危害和損失。因此，全面了解畜禽舍內(nèi)、外環(huán)境空氣微生物菌群、含量、分布情況及特性，對于建立氣源性傳染的傳播模型及流行病的預(yù)防和監(jiān)控十分重要。

國外在畜禽舍環(huán)境與人類和動物的健康方面的眾多研究表明，空氣質(zhì)量狀況會影響人及動物健康，空氣質(zhì)量差會導(dǎo)致動物及人類一些疾病的發(fā)生，主要是呼吸道疾病、免疫下降等，特別是空氣中的微生物及其代謝產(chǎn)物（內(nèi)毒素、氨、硫化氫等），是影響動物健康的潛在因素［1］。

國內(nèi)外對細菌氣溶膠的研究報道中，革蘭氏陰性菌僅占較小的比例，但其中包含了大量的致病菌和條件性致病菌，其濃度和組分對于動物舍內(nèi)環(huán)境質(zhì)量具有重要意義。許多科研工作者都對動物舍內(nèi)環(huán)境中的革蘭氏陰性菌濃度和組分進行了研究［2-4］。Zucker-BA等［5］對4個牛舍、1個豬舍和1個雞舍中的氣載革蘭氏陰性菌的種類和含量進行過研究，發(fā)現(xiàn)畜舍內(nèi)氣載革蘭氏陰性菌占氣載需氧菌總數(shù)的0.02%～5.20%，未分離出厭氧革蘭氏陰性菌；并指出革蘭氏陰性菌中主要包括腸桿菌、假單胞菌及奈瑟氏菌，腸桿菌中以大腸桿菌和成團腸桿菌為主，空氣濕度大的地方假單胞菌的含量也非常高。本研究對3個不同結(jié)構(gòu)和飼養(yǎng)方式下的兔場兔舍中氣載需氧、厭氧革蘭氏陰性活菌的含量進行了測定，并對微生物氣溶膠中革蘭氏陰性菌菌群組成進行了檢測，以期為相關(guān)疫病的預(yù)防和監(jiān)控提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 兔舍情況

實驗兔場有兩個開放式兔舍（A、B）和一個封閉式兔舍（C）。開放式兔舍為雙列3層式，兔舍長15m，寬4m，高3m；封閉式兔舍長6m，寬4m，高3m，采用空調(diào)控溫。舍內(nèi)外溫濕度、風(fēng)速在采樣時同時進行檢測，具體指標(biāo)見表1。

表1 3個兔舍物理指標(biāo)

1.2 方法

1.2.1 氣載需氧菌和革蘭氏陰性菌樣本的采集 采用2臺國際標(biāo)準(zhǔn)收集器ANDERSEN-6級撞擊式空氣微生物樣品收集器［6］，采集時標(biāo)準(zhǔn)流量28.3 L/min，分別選用5%的公綿羊血瓊脂和麥康凱3號培養(yǎng)基（Oxoid公司）為采樣介質(zhì)，收集器設(shè)置于兔舍中央，放置高度50～80 cm，驅(qū)動時間根據(jù)不同衛(wèi)生條件掌握在1～5min，保證六節(jié)平皿上都能采到菌樣，菌落數(shù)以20～250CFU為宜。1.2.2氣載需氧菌濃度計算 采樣后血瓊脂平板置于恒溫箱37℃需氧培養(yǎng)24 h后，計算各瓊脂平板上的菌落數(shù)，經(jīng)ANDERSEN校正表校正后，根據(jù)通氣量得到每立方米空氣中的氣載需氧活菌含量。按公式①計算：

其中，Q1為六節(jié)平皿上菌落數(shù)量矯正后的總和；t為采樣時間（min）。

1.2.3 革蘭氏陰性菌濃度計算 用麥康凱3號培養(yǎng)基采集的樣本一部分在37℃條件下培養(yǎng)24 h，另一部分放入YQX型厭氧培養(yǎng)箱中，40℃厭氧培養(yǎng)24 h，其厭氧環(huán)境為N288%、H27%、CO25%。所有的紅色菌落經(jīng)過革蘭氏染色和“KOH反應(yīng)”試驗鑒定。計算各平板上的革蘭氏陰性菌菌落數(shù)，ANDERSEN采集的樣本經(jīng)ANDERSEN校正表校正后，根據(jù)通氣量得到每平方米空氣中的氣載革蘭氏陰性活菌。按公式①計算。

1.2.4 革蘭氏陰性菌菌群的鑒定方法

1.2.4.1 需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性菌的鑒定 將分離得到的純菌種分別接種O-F生化管和氧化酶試紙，按照標(biāo)準(zhǔn)操作方法進行，再根據(jù)結(jié)果進行初步分離。O-F試驗氧化（F）且氧化酶陽性（+）的菌株采用API-20E（Bio Merieux，Marcy-I’Etoile，F(xiàn)rance）實驗進行鑒定，其他菌株采用API-20NE實驗進行鑒定。操作及結(jié)果判讀按試劑盒說明完成。

1.2.4.2 專性厭氧革蘭氏陰性菌的鑒定 由于本次實驗分離到的菌株大多數(shù)為兼性厭氧革蘭氏陰性菌，未分離到專性厭氧革蘭氏陰性菌，故未進行本實驗。

2 結(jié)果

2.1 氣載需氧菌和氣載革蘭氏陰性菌含量

經(jīng)過檢測，3個兔舍內(nèi)氣載需氧菌含量在0.78×103～20.1×103CFU/m3之間，總氣載革蘭氏陰性菌含量在29～58CFU/m3之間，占需氧菌總數(shù)的2.12%～10.20%。兔舍C內(nèi)氣載革蘭氏陰性菌含量最高，兔舍B內(nèi)含量最低（見表2）。可吸入的氣載革蘭氏陰性菌含量在19～35CFU/m3之間，兔舍C內(nèi)含量最高，兔舍B內(nèi)含量最低（見表2）。而且，每一個兔舍內(nèi)氣載需氧菌和革蘭氏陰性菌含量差異均不顯著（P＞0.05）?？晌氲臍廨d革蘭氏陰性菌含量占總氣載革蘭氏陰性菌含量的比例在62.7%～65.1%之間，而且3個兔舍之間無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 3個兔舍內(nèi)氣載革蘭氏陰性菌含量

2.2 氣載革蘭氏陰性菌菌群組成

經(jīng)過對3個兔舍環(huán)境中氣載革蘭氏陰性菌成分分析，結(jié)果表明，兔舍環(huán)境中腸桿菌科細菌是革蘭氏陰性菌的主要組分（表3），分別占革蘭氏陰性菌含量的64.3%（兔舍A）、84.2%（兔舍B）和72.3%（兔舍C）；其次是假單胞菌、奈瑟氏菌和巴氏桿菌。而在腸桿菌科中大腸桿菌是主要菌群（表4），分別占腸桿菌科細菌含量的90.5%（兔舍A）、92.5%（兔舍B）和87.6%（兔舍C）。

表3 3個兔舍舍內(nèi)氣載革蘭氏陰性菌菌群分析%

表4 3個兔舍舍內(nèi)氣載腸桿菌科中各成分分析%

3 討論

3.1 兔舍內(nèi)氣載革蘭氏陰性菌的空氣動力學(xué)分析

細菌在ANDERSEN-6空氣微生物采樣器1～6層級上（總的）分布的統(tǒng)計采用平均值的統(tǒng)計方法。因為不同結(jié)構(gòu)、不同飼養(yǎng)方式的兔舍細菌含量差異較大，采用平均數(shù)能較好地反映數(shù)值分布。經(jīng)統(tǒng)計，可吸入的氣載革蘭氏陰性菌含量占總氣載革蘭氏陰性菌含量的比例在62.7%～65.1%之間，這些顆粒的空氣動力學(xué)直徑（Dae50）一般在5.4μm以下，能在空氣中做BROWN運動，停留時間長，可進入人畜的氣管、支氣管、細支氣管甚至肺泡，在環(huán)境條件或飼養(yǎng)因素改變和動物體抵抗力下降時，容易造成下呼吸道感染，對人及動物健康構(gòu)成威脅。

3.2 兔舍氣載革蘭氏陰性菌和氣載需氧菌濃度

本實驗測得兔舍內(nèi)氣載需氧革蘭氏陰性活菌含量介于0.39×102～10.30×102CFU/m3之間，未檢測出厭氧革蘭氏陰性菌，說明進入空氣中厭氧革蘭氏陰性菌均未能形成芽孢，很快死亡。氣載需氧菌活菌含量介于0.78× 103～20.10×103CFU/m3之間。氣載革蘭氏陰性活菌占氣載需氧菌活菌總數(shù)的2.12%～10.20%。WIEGAND-B等［7］測定肉雞舍空氣塵埃中的細菌總數(shù)為2.1×109CFU/g，相當(dāng)于7.7×106CFU/m3空氣；Dutkiewicz-J等［8］測定豬舍、牛舍、馬舍中嗜溫菌含量分別在568.7×103～1 408.7×103CFU/m3、43.9×103～280.5×103CFU/m3、26.2×103～150.1×103CFU/m3之間；Zucker-BA等［9］測定牛舍中的需氧細菌含量和需氧革蘭氏陰性細菌含量分別為6.96×103～1.06×105CFU/m3和7.20×100～5.05×102CFU/m3空氣。本次實驗在兔舍中測得的細菌總數(shù)與其他動物舍比較相對較低，這可能與家兔本身的生活習(xí)性和飼養(yǎng)方式（開放式或半開放式、籠養(yǎng)、顆粒料等）有直接關(guān)系。

3.3 兔舍環(huán)境革蘭氏陰性菌菌群分析

在所測量的3個兔舍環(huán)境中，革蘭氏陰性菌中以腸桿菌科細菌為主，而且在腸桿菌中又以大腸桿菌占大多數(shù)（表4），類似的結(jié)果以往的研究者也在豬舍和禽舍環(huán)境中檢測到［5］。在奈瑟氏菌科中以黏液奈瑟氏菌最為常見（在兔舍A中占80.0%，在兔舍B中占57.1%，在兔舍C中占55.6%）。奈瑟氏菌科中有多種奈瑟氏菌（如年液奈瑟氏菌）可以在溫血動物和人的黏膜處共生，特別是在鼻咽部及其結(jié)合處［10-11］。在兔舍環(huán)境中檢測到很多假單胞菌科細菌，其中包括常見的銅綠假單胞菌，在以往的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)此菌是引起人及動物傷口感染的主要菌［12-13］。另外，在其中的兩個兔舍環(huán)境中（兔舍A和C）還檢測到巴氏桿菌（表3），并且以多殺巴斯德氏菌為主，兔舍A中76.5%為多殺巴斯德氏菌，兔舍C中多殺巴斯德氏菌占84.5%，這與Kawamoto等［14］在日本報道的結(jié)果基本一致。多殺巴斯德氏菌是常見的呼吸道致病菌，通常巴斯德氏菌病與兔的上呼吸道疾?。ㄒ员茄?、膿性鼻液為主要癥狀）并發(fā)，有時還伴有結(jié)膜炎、肺炎、潰瘍、生殖器感染及敗血癥等［15-16］。在調(diào)查過程中，發(fā)現(xiàn)兔舍A和C中有些兔有鼻炎癥狀，而在兔舍B內(nèi)未發(fā)現(xiàn)，與檢測結(jié)果相一致。

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Detection on Airborne Gram-negative Bacterial Flora in Rabbitries

Duan Huiyong
（DepartmentofBiotechnology Engineeringof Taishan Polytechnic，Tai’an 271000，Shandong,China）

The concentration ofairborne aerobic bacteria，airborneaerobic gram-negativebacteriaand the species composition of the airborne gram-negative bacterial flora in 3 rabbitriesweremeasured using 5%buck blood-blood agar and MacConkey agar No.3（Oxoid）with Andersen-6 sampler.The resultsshowed that thenumberof totalairborne aerobic bacteriawasbetween 780 to 20 100CFU/m3，the number ofairborne aerobic gram-negative bacteria between 39 to 1 030 CFU/m3，the species composition of the airborne gram-negative bacterial flora included Enterobacteriaceae，Neisseriaceae，Pasteurellaceae and Pseudomonadaceae. Most of gram-negative Enterobacteriaceae isolated was E.coli.Besides，in two rabbit houses，Pasteurella multocida，themost common respiratory pathogen of rabbits，was isolated.

rabbithouse；airbornegram-negativebacteria；bioaerosol

S852.61

A

2095-3887（2017）04-0034-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.04.009

2017-04-12

段會勇（1975-），男，講師，博士，主要從事畜禽環(huán)境病原微生物的研究。