馮華

（云蒙山合作示范牧場,四川 宣漢 636150）

改良試管凝集試驗和虎紅平板凝集試驗檢測羊布魯氏菌病結果比較

馮華

（云蒙山合作示范牧場,四川 宣漢 636150）

虎紅平板凝集試驗方便、快捷，目前已廣泛應用于養(yǎng)殖場羊布魯氏菌病的普查，但其假陽性情況有待探究。利用改良試管凝集試驗對虎紅平板凝集試驗檢出的陽性個體進行分析，發(fā)現(xiàn)陽性率僅為88.8%。表明虎紅平板凝集試驗存在假陽性，可先用虎紅平板凝集試驗進行大面積普查，陽性樣品再用改良試管凝集試驗復核。

改良試管凝集試驗；虎紅平板凝集試驗；布魯氏菌病

布魯氏菌病簡稱“布病”，有6個種，即馬耳他布魯氏菌（Brucellamelitensis）、流產布魯氏菌（Br.abortus）、豬布魯氏菌（Br.suis）、林鼠布魯氏菌（Br.neotomae）、綿羊布魯氏菌（Br.ovis）和狗布魯氏菌（Br.canis）［1］。習慣上稱馬耳他布魯氏菌為羊布魯氏菌，流產布魯氏菌為牛布魯氏菌［2］。各個種與生物型菌株之間、形態(tài)及染色特性等方面無明顯差別［3］。布魯氏菌的抵抗力和其他不能產生芽胞的細菌相似，為細小的球桿菌、無鞭毛、有毒力的菌株［4］。流產布魯氏菌主要宿主是牛，而羊、猴、豚鼠有一定易感性；馬耳他布魯氏菌，主要宿主是山羊和綿羊［5］，可以由羊傳入牛群，也可由牛傳播于牛，而其他動物對它的易感性則與流產布魯氏菌相同［6］。檢測羊布魯氏菌病血清抗體的方法有很多種類，本試驗用虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗對四川省宣漢縣一個規(guī)模化山羊養(yǎng)殖場和一個山羊養(yǎng)殖專業(yè)合作社的1 298份血清樣品進行虎紅平板凝集試驗（RBPT），將虎紅平板凝集試驗檢出陽性的358份樣品再用試管凝集試驗（SAT）檢測對比［7］，以供廣大養(yǎng)殖場參考。

1 材料與方法

1.1 材料

待檢樣品1 298份采集于四川省宣漢縣李氏養(yǎng)殖場和專業(yè)合作社，待檢血清樣品放存于-20℃冰箱內。

1.2 診斷試劑

布魯氏菌病陽性和陰性診斷血清由四川省動物疫病預防控制中心實驗室提供，批號：川生藥字（2014）4017451。布魯菌虎紅平板凝集試驗抗原、布魯菌改進試管凝集試驗抗原同樣由四川省動物疫病預防控制中心實驗室提供，批號分別是20140812、川生藥字（2014）4017451。微量移液器，96孔U型底微量反應板實驗室自購。

1.3 方法

1.3.1 血樣采集及血清制備 采血5mL，1 000 r/min離心5min，取上清液裝入5mL試管置-20℃的冰箱內保存。以備檢測。

1.3.2 虎紅平板凝集試驗（RBPT） 在潔凈滅菌的平板凝集玻璃板片上標注樣品編號和陰陽對照組，用移液器吸取虎紅平板凝集抗原被檢血清30μL滴入相應的檢測點內，再用移液器分別吸被檢樣品30 pμL混合均勻，每吸取一個樣品更換一次吸頭。在20℃時反應3～5min，以陽、陰性血清對比觀察結果并記錄。若被檢血清有顆粒狀或絮狀物出現(xiàn)均判為陽性，相反則判為陰性。

1.3.3 改良試管凝集試驗（MSAT） 血清樣品和標準血清分別稀釋1∶200倍，各血清稀釋液和1∶20倍抗原稀釋液各60μL以100μL移液器加入96孔U型底微量反應板中，于平板振蕩器上混勻后將反應板以密封膜密封后放置37℃溫箱反應，22～24 h后取出觀察試驗結果。

1.3.4 標記原則 100%凝集即反應孔底部無點狀白色沉淀，整個反應孔呈片狀凝集，記做“#”；75%凝集即反應孔底部凝集物中稍有點狀白色沉積，75°傾斜反應板時不流，記做“+++”；50%凝集即反應孔底部有明顯的凝集物和點狀白色沉積，75°傾斜反應板時微流，即白色沉積物不全部下流，記做“++”；25%凝集即反應孔底部有點狀白色沉積，點狀邊緣模糊發(fā)散，75°傾斜反應板時白色沉積物幾乎全流，記做“+”；不凝集即反應孔底部僅有點狀白色沉積，75°傾斜反應板時白色沉積物全部下流，記做“－”。反應結果為“++”的為陽性，反應結果為“－”的為陰性。

2 檢測結果

所采集1 298份羊血清樣品，虎紅平板凝集試驗檢出陽性樣品358份，陽性率27.6%，其中李氏養(yǎng)殖場陽性率57.4%，專業(yè)合作社陽性率19.0%；利用改良試管凝集試驗（MSAT）復核358份陽性樣本，檢出陽性樣本318份，陽性率88.8%，其中李氏養(yǎng)殖場陽性率94.6%，專業(yè)合作社陽性率83.8%。檢測結果見表1。

表1 虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗檢測羊血清結果

3 分析與討論

通常情況下，RBPT使用方便、快捷，適用于大面積普查，但易出現(xiàn)假陽性［8］。MSAT是我國布魯氏菌病診斷的法定方法SAT的升級，既能定性，也能定量，判定容易、檢測更精準，也可作為布病早期診斷，但往往因感染動物的抗體滴度達不到檢測水平，不易檢測出陽性，從而易造成誤診和漏診。且MSAT特異性高，檢測比較準確，但操作費工、費時［9］，不利于鄉(xiāng)鎮(zhèn)大面積普查。本研究發(fā)現(xiàn)，采用RBPT檢測羊布魯氏菌病陽性檢出率27.6%；采用MSAT檢測羊布魯氏菌病358份血清樣品，檢測出陽性樣品318份，可疑和陰性樣品共40份，陽性檢出率88.8%。本實驗證明了用RBPT檢測血清樣品可能存在假陽性樣品現(xiàn)象，說明RBPT可用于養(yǎng)殖場布魯氏菌病的大面積普查的初步篩選，但不能定性定量。因此，可先用RBPT普查，陽性樣品再用MSAT復核，以便作出準確的判斷［10］。

［1］ 孟茹.布魯氏菌實時熒光定量PCR檢測方法與血清快速診斷試紙的初步研究［D］.新疆石河子：石河子大學，2010.

［2］ 劉鳳.豬疥螨病的科學防治［J］.中國畜禽種業(yè)，2015（10）：117-118.

［3］ 姜玉嫻，孫雷.應用RBPT監(jiān)測布魯氏菌病誤差原因分析［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2009（4）：41.

［4］ 侯寶華，喬平平，黨志喜.奶牛布病防制主要技術措施［J］.中國牛業(yè)科學，2010（6）：100-101.

［5］ 楊春華，邱昌慶，曹小安.流產布魯氏菌omp25基因的克隆與原核表達［J］.中國獸醫(yī)科學，2007（6）：465-468.

［6］ 王洪喆.動物布病及人間布病的預防［J］.動物保健，2006（9）：31-32.

［7］ 項愛紅.常規(guī)試管凝集試驗與虎紅平板凝集試驗檢測布病抗體結果對比分析［J］.河南預防醫(yī)學雜志，2016（1）：32-33.

［8］ 樊三忠，劉金彪，陳冬毅，等.虎紅平板凝集試驗與試管凝集試驗檢測奶牛布魯氏菌病的比較［J］.中國動物檢疫，2009（9）：52-53.

［9］ 李鋒，王莉，柴春彥，等.檢測牛乳中三聚氰胺的間接競爭ELISA方法的建立［J］.中國動物檢疫，2009（9）：47-48，53.

［10］李智偉，馬秀敏，張躍新，等.布魯氏菌的分子生物學診斷技術［J］.中國病原生物學雜志，2011（11）：861-864，827.

S826.7

A

2095-3887（2017）04-0069-02

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.04.020

2017-04-26

馮華（1978-），男，獸醫(yī)師，大專。研究方向：畜牧獸醫(yī)。