周 梅，狄 冉，胡文萍，王翔宇，張效生，張金龍，劉秋月，儲明星

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

遺傳育種與繁殖

小尾寒羊和蘇尼特羊CRH和POMC基因在繁殖相關(guān)組織中的差異性表達(dá)

周 梅1，狄 冉1，胡文萍1，王翔宇1，張效生2，張金龍2，劉秋月1，儲明星1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

為了探索CRH和POMC基因與綿羊季節(jié)性發(fā)情之間的關(guān)系，利用熒光定量PCR檢測了兩個基因在四季發(fā)情小尾寒羊和季節(jié)性發(fā)情蘇尼特羊8個重要繁殖相關(guān)組織中的表達(dá)水平。結(jié)果表明：CRH在下丘腦和大腦中高表達(dá)；POMC在垂體中表達(dá)量最高，其次是下丘腦，在其他組織中均呈痕量表達(dá)，但小尾寒羊與蘇尼特羊各組織間CRH和POMC基因的表達(dá)均無顯著性差異（P＞0.05）。

綿羊；CRH；POMC；組織表達(dá)

綿羊季節(jié)性發(fā)情性狀是制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一，該性狀受季節(jié)、光照、環(huán)境以及營養(yǎng)等多方面的影響，其中受季節(jié)影響最大。綿羊季節(jié)性發(fā)情的特點表現(xiàn)為春季不發(fā)情，夏、秋和冬季發(fā)情，這在一定程度上制約了綿羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。我國除小尾寒羊和湖羊等少數(shù)常年發(fā)情綿羊品種外，絕大部分綿羊品種均表現(xiàn)出季節(jié)性發(fā)情的特點。因此，對影響綿羊季節(jié)性發(fā)情相關(guān)基因進(jìn)行研究，對于提高綿羊繁殖效率、加快綿羊育種進(jìn)程非常重要。

促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin-releasing hormone，CRH）是促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素因子家族成員之一［1］。CRH與垂體前葉的CRHR1結(jié)合之后能夠激活下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pituitaryadrenalaxis，HPA），以對抗外界的應(yīng)激［2］。CRH基因能夠在小鼠的卵巢、子宮以及胎盤中表達(dá)，并且參與排卵和黃體退化等過程［3］。阿片黑素促皮質(zhì)激素原（proopiomelanocortin，POMC）則是垂體促黑素激素細(xì)胞和促腎上腺皮質(zhì)激素細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的多種功能蛋白，如α-促黑激素（α-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH）和促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）等的前體蛋白，與下丘腦-垂體-腎上腺軸控制的機體應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)［4］，還能夠抑制食物的攝入并降低體重，從而維持機體能量平衡［5］。

目前研究可知，CRH和POMC基因分別在哺乳動物的下丘腦和垂體中高表達(dá)［6］，而下丘腦和垂體對綿羊季節(jié)性發(fā)情相關(guān)激素如GnRH、FSH、LH等的分泌有著非常關(guān)鍵的調(diào)控作用，由此推測CRH和POMC基因很有可能與綿羊季節(jié)性繁殖有關(guān)。因此，本研究對CRH和POMC基因在小尾寒羊（常年發(fā)情）和蘇尼特羊（季節(jié)性發(fā)情）8個組織間的表達(dá)差異進(jìn)行了研究，以揭示其影響綿羊季節(jié)性發(fā)情的內(nèi)在機制，為綿羊分子育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和主要試劑

RNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司（北京），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRTReagentKit）和熒光定量染料（SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ）均購于TaKaRa公司（大連）；Taq PCRMasterMix購于拓英坊科技有限公司（北京）。

1.2 組織總RNA的提取和檢測

采用動物組織總RNA提取試劑盒（天根，北京）加Trizol（Invitrogen，美國）提取各組織總 RNA，并使用Nanodrop2000檢測了提取RNA的濃度和OD值，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank提供的綿羊CRH和POMC基因mRNA序列（登錄號分別為：XM_015097787.1，XM_0121659-82.2），利用Primer Premier3.0軟件進(jìn)行跨外顯子引物設(shè)計，以β-actin（NM_001009784）作為內(nèi)參基因。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。引物名稱和序列、退火溫度以及擴增片段大小見表1。

表1 綿羊CRH和POMC基因的引物信息

1.4 cDNA合成

利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系總體積為20μL，需要量組成見表2。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃15min，85℃5 s，獲得cDNA第一鏈。全程操作在冰上進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行5倍稀釋，用持家基因β-actin進(jìn)行PCR檢測，將符合標(biāo)準(zhǔn)的cDNA置于-20℃保存，以用于檢測目的基因的表達(dá)。

1.5 PCR反應(yīng)

換屆以來，機關(guān)各委室啟動實施了“一委室一亮點”工程，每年重點抓好一項創(chuàng)新性工作，為機關(guān)建設(shè)創(chuàng)造條件、注入活力。

表2 反轉(zhuǎn)錄體系

PCR反應(yīng)體系總體積為20μL，需要量組成見表3。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物大小。

表3 PCR體系

1.6 實時熒光定量PCR

1.6.1 實時熒光定量PCR體系和程序 反應(yīng)體系總體積為20μL，需要量組成見表4。PCR程序：95℃預(yù)變性5 s，95℃變性5 s，60℃30 s，40個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后對熔解曲線進(jìn)行分析。

表4 實時熒光定量PCR體系

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將cDNA樣本5倍稀釋后，進(jìn)行2倍梯度稀釋獲得5個濃度梯度（1、1/2、1/4、1/8、1/16）的cDNA樣品。用這些cDNA作為模板對目的基因和持家基因進(jìn)行熒光定量PCR，以濃度梯度的對數(shù)值（10為底數(shù)）為橫坐標(biāo)，以檢測所得Ct值為縱坐標(biāo)，繪制目的基因和持家基因標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.3 實時熒光定量檢測與數(shù)據(jù)分析 熒光定量檢測利用Roche LightCycler?480Ⅱ型熒光定量PCR儀進(jìn)行，以β-actin為內(nèi)參基因，每個樣品重復(fù)檢測3次。采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達(dá)量，用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用一般線性模型及最小顯著差數(shù)（leastsignificantdifference，LSD）法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取與cDNA合成

利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳對RNA完整性進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，RNA完整性良好，28S條帶亮度大于18S且二者均無明顯降解（圖1），以反轉(zhuǎn)錄之后的cDNA為模板對CRH、POMC和β-actin進(jìn)行PCR擴增，設(shè)計的CRH、POMC和β-actin三對引物擴增效果良好（圖2），目的片段與預(yù)期的112、142和97 bp一致，且條帶單一，可以用于后續(xù)的熒光定量試驗。

圖1 8個組織RNA電泳檢測

圖2 CRH、POMC和β-actin在8個組織中的PCR產(chǎn)物電泳檢測

2.2 綿羊CRH基因和POMC基因在不同品種繁殖相關(guān)組織中的表達(dá)

運用熒光定量PCR對常年發(fā)情綿羊品種（小尾寒羊）和季節(jié)性發(fā)情綿羊品種（蘇尼特羊）8個繁殖相關(guān)組織CRH基因和POMC基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果見圖3。

圖3 CRH和POMC基因在各組織中的表達(dá)水平

兩個品種比較發(fā)現(xiàn)，CRH基因和POMC基因在兩個綿羊品種中均表現(xiàn)出組織特異性表達(dá)的特點。其中，CRH在下丘腦和大腦中表達(dá)量最高，在其他組織中呈痕量表達(dá)，POMC基因在垂體中的表達(dá)量最高，其次是下丘腦，在其他組織中呈痕量表達(dá)，但小尾寒羊（常年發(fā)情）與蘇尼特羊（季節(jié)性發(fā)情）各組織間CRH基因和POMC基因的表達(dá)均無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論與結(jié)論

CRH主要由下丘腦室旁核中的神經(jīng)元分泌，能夠刺激垂體前葉分泌ACTH，從而對腎上腺皮質(zhì)的功能和發(fā)育進(jìn)行調(diào)節(jié)［7］。POMC是ACTH的前體，它對于動物的代謝和生殖功能的維持非常重要，其分泌直接受到CRH的調(diào)控，ACTH的分泌方式為脈沖式，且釋放的幅度和頻率具有晝夜交替節(jié)律性［8］。褪黑激素（melatonin，MT）是由松果體分泌的一種胺類激素，其分泌也呈現(xiàn)出晝夜節(jié)律性［9］。研究表明，MT在綿羊季節(jié)性發(fā)情過程中扮演著非常重要的角色［10］。

CRH能夠刺激POMC和ACTH的分泌，而ACTH與MT釋放的頻率和幅度在某種程度上呈現(xiàn)出相反的特點，MT又與綿羊的季節(jié)性發(fā)情存在密切關(guān)聯(lián)，由此推測CRH和POMC基因很有可能與綿羊的季節(jié)性發(fā)情有關(guān)。

本研究通過提取同期發(fā)情后第7天（即黃體期）常年發(fā)情小尾寒羊和季節(jié)性發(fā)情蘇尼特羊繁殖相關(guān)組織RNA，并用RT-PCR技術(shù)檢測了CHR基因和POMC基因在大腦、小腦、下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮體以及子宮角8個組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CHR基因mRNA在下丘腦和大腦中高表達(dá)，在小腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮體和子宮角中呈痕量表達(dá)；POMC基因在垂體中的表達(dá)量最高，其次是下丘腦，在小腦、卵巢、輸卵管、子宮體和子宮角中呈痕量表達(dá)。但小尾寒羊（常年發(fā)情）與蘇尼特羊（季節(jié)性發(fā)情）各組織間CRH基因和POMC基因的表達(dá)均無顯著差異（P＞0.05）。下丘腦和垂體是分泌多種與綿羊季節(jié)性繁殖相關(guān)生殖激素的關(guān)鍵組織，CRH和POMC分別在下丘腦和垂體中高表達(dá)初步揭示了二者在綿羊季節(jié)性繁殖中的重要位置。

本研究所選擇的綿羊品種均處于黃體期，這也可能是導(dǎo)致CRH和POMC的表達(dá)量在常年發(fā)情小尾寒羊和季節(jié)性發(fā)情蘇尼特羊之間無顯著差異（P＞0.05）的原因，但從目前的實驗結(jié)果可以看出，兩個基因在常年發(fā)情小尾寒羊垂體和下丘腦中的表達(dá)均表現(xiàn)出高于季節(jié)性繁殖蘇尼特羊的趨勢，提示二者可能與季節(jié)性發(fā)情存在一定的聯(lián)系。國外對綿羊季節(jié)性繁殖相關(guān)基因的表達(dá)研究也集中于下丘腦、垂體、子宮和卵巢，同時也會對不同時期及不同時間點之間的基因表達(dá)進(jìn)行比較，并對相關(guān)生殖激素的分泌進(jìn)行測定。而在本實驗中，CRH和POMC在卵泡期的表達(dá)量因缺乏相關(guān)樣品而無法得知，有待于進(jìn)一步研究。至于二者在長日照或短日照不同時間點之間是否存在差異本實驗室正在進(jìn)行相關(guān)研究。本研究對于進(jìn)一步探究CRH和POMC基因的功能及其與綿羊季節(jié)性發(fā)情之間的關(guān)系具有參考價值。

［1］ Subbannayya T，Balakrishnan L，Sudarshan G，etal.An integratedmap of corticotropin-releasing hormone signaling pathway［J］.Journal of CellCommunication and Signaling，2013，7（4）：295-300.

［2］ Graf C，Kuehne C，Panhuysen M，et al.Corticotropin-releasing hormone regulates common target geneswith divergent functions in corticotrope and neuronal cells［J］.Molecular&Cellular Endocrinology，2012，362（1-2）：29-38.

［3］ Kiapekou E，Zapanti E，Voukelatou D，et al.Corticotropin-releasing hormone inhibits in vitro oocyte maturation in mice［J］.Fertility& Sterility，2011，95（4）：1497-1499.

［4］ Jenks B G.Regulation of proopiomelanocortin gene expression：an overview of the signaling cascades，transcription factors，and responsive elements involved［J］.Annalsof the New York Academy of Sciences，2009，1163（1）：17-30.

［5］ King CM，Hentges ST.Relative number and distribution ofmurine hypothalamic proopiomelanocortin neurons innervating distinct target sites［J］.PLoSONE，2011，6（10）：e25864.

［6］ Manojlovic＇-Stojanoski M，Nestorovic＇N，Trifunovic＇S，et al.Dexamethasone exposure affects paraventricular nucleus and pituitary corticotrophs in female rat fetuses：An unbiased stereologicaland immunohistochemicalstudy［J］.Tissue&Cell，2016，48（5）：516-523.

［7］ Sautron V，Terenina E，Gress L，et al.Time course of the response to ACTH in pig：biologicaland transcriptomic study［J］.BMCGenomics，2015，16：961.

［8］ DengQ，Riquelme D，Trinh L，etal.Rapid glucocorticoid feedback inhibition of ACTH secretion involves ligand-dependentmembrane association ofglucocorticoid receptors［J］.Endocrinology，2015，156（9）：3215-3227.

［9］ LiY，Cassone VM.Clock-controlled regulation of the acute effects of norepinephrine on chick pineal melatonin rhythms［J］.Journal of BiologicalRhythms，2015，30（6）：519-532.

［10］Saxena V，Jha B，Meena A，et al.Assessment of genetic variability in the coding sequenceofmelatonin receptor gene（MTNR1A）in tropical arid sheep breeds of India［J］.Reproduction in Domestic Animals，2015，50（3）：517-521.

D ifferent Exp ression o f CRH and POMC Genes in Rep roductive Related Tissues in Sm all-tailHan Sheep and Sunite Sheep

Zhou Mei，Liu Qiuyue，Chu Mingxing，etal
（Key Laboratory ofAnimalGeneticsand Breeding and Reproduction ofMinistry ofAgriculture，InstituteofAnimalScience，Chinese Academy ofAgriculturalSciences，Beijing100193，China）

In order to explore the association of CRH and POMC with seasonalestrus in sheep,real-time PCRwasused to detect CRH and POMC mRNA expression in eight important reproductive related tissues.Year-round estrous Small-tailhan ewes and seasonalestrous Sunite eweswere selected as testanimals.The results showed that the expression of CRH was athigh level in hypothalamus and cerebrum，while POMC was the highest in pituitary，followed by hypothalamus.The expression levels were extremely low in all the other tissues for two genes.Both CRH and POMC expression had no significant differences between Small-tailhan ewesand Suniteewes（P＞0.05）.

sheep；CRH；POMC；tissueexpression

S826.2

A

2095-3887（2017）04-0001-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.04.001

2017-05-05

國家自然科學(xué)基金項目（31472078，31402041，31572371，31501941，31501926）；國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（CARS-39）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（Y2017JC24，2013ywf-zd-1，2015ywf-zd-2，.2015ywf-zd-8）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS13)；內(nèi)蒙古自治區(qū)戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金計劃；寧夏農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新先導(dǎo)資金項目（DWJLC-2016001）

周梅（1988-），女，在讀博士研究生，主要從事動物分子育種研究。

劉秋月，副研究員，博士；儲明星，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事羊優(yōu)異繁殖性狀的分子機理研究。