程千 魏雅君 蔣俊* 徐希明

1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212001 2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013

再生藥物是當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的前沿與熱點(diǎn)，對其再生機(jī)制的深入研究將成為人類醫(yī)學(xué)史上的一大革命。近年來，眾多研究表明再生藥物能夠通過影響細(xì)胞微環(huán)境和(或)細(xì)胞信號通路，影響細(xì)胞的自我更新能力和定向分化方向，進(jìn)而體現(xiàn)相應(yīng)細(xì)胞功能[1]，實(shí)現(xiàn)組織器官的再生，如加味丹參飲能促進(jìn)壞死心肌組織心肌特異性蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化，促進(jìn)心肌組織再生[2]；鹿茸多肽能夠抑制成骨樣細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子TNF和白細(xì)胞介素-α，促進(jìn)軟骨和成骨樣細(xì)胞再生[3]等。目前，骨再生因為顯著的代表性、可操作性和實(shí)用性，成為了深入研究再生藥物機(jī)制的切入點(diǎn)。大量文獻(xiàn)報道不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮(DGEFs)單體均具有基于再生機(jī)制的抗骨質(zhì)疏松作用，但作用強(qiáng)度存在顯著差異，而藥物穿透細(xì)胞膜并與細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)結(jié)合是影響其藥效強(qiáng)度的重要環(huán)節(jié)，因此闡述不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮在骨細(xì)胞微環(huán)境的藥物代謝動力學(xué)是深入解析其骨再生機(jī)制的重要研究內(nèi)容。本文在多年的研究基礎(chǔ)上，結(jié)合前期實(shí)驗數(shù)據(jù)，提出了全新的假說和研究思路，以期深入闡明不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮抗骨質(zhì)疏松的科學(xué)內(nèi)涵。

1 不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮(DGEFs)具有基于再生機(jī)制的抗骨質(zhì)疏松作用

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿或朝鮮淫羊藿的干燥葉，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕作用[4]。從淫羊藿中分離得到的化合物超過270種，其中淫羊藿黃酮含量最高[5,7]。這類黃酮成分主要包括，寶藿苷I (Baohuside I)、淫羊藿苷(Icariin)、朝藿定A、B、C(Epimedin A、B、C)[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，朝藿定A、B、C、淫羊藿苷、寶藿苷I經(jīng)大鼠口服給藥后，在其血清、膽汁或者糞便中能檢測到淫羊藿素(Icaritin)，如此淫羊藿素也不可忽視地成為來源于淫羊藿的重要活性成分。這些黃酮類化合物以淫羊藿素為母核，選擇性地在C-7位連接葡萄糖(glucose，glc)或者在C-3位連接不同數(shù)量的鼠李糖(rhamnose，rha)、glc、木糖(xylose,xyl)。此外，淫羊藿素還有一個同分異構(gòu)體苷元-環(huán)淫羊藿素(C-icaritin)[5]。這些黃酮成分化學(xué)結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系如圖1所示。

研究發(fā)現(xiàn)，朝藿定B、淫羊藿苷、寶藿苷I能夠促進(jìn)雌激素依賴的成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)活力而發(fā)揮骨保護(hù)作用[9,10]；朝藿定B、淫羊藿苷、寶藿苷I能刺激OB形成，抑制骨質(zhì)疏松小鼠破骨細(xì)胞分化[11]。淫羊藿總黃酮及其中所含淫羊藿苷和寶藿苷I能調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成及其活性，抑制破骨細(xì)胞的分化和骨吸收[12]; 淫羊藿總黃酮還能促進(jìn)骨間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchyma stem cells，MSCs)的成骨分化，促進(jìn)骨再生和修復(fù)功能[13]。淫羊藿總黃酮及微量的淫羊藿苷和朝藿定 B能對抗?jié)娔崴升堈T導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松[14,15]。因此，淫羊藿黃酮是通過促進(jìn)MSCs的成骨性分化和OB的分化成熟，抑制破骨細(xì)胞的分化和骨吸收活性，實(shí)現(xiàn)骨再生的，在骨質(zhì)疏松治療方面具有重要的研究價值和應(yīng)用前景。

2 在骨細(xì)胞微環(huán)境的藥代動力學(xué)過程是淫羊藿黃酮發(fā)揮促骨再生作用的關(guān)鍵

骨質(zhì)疏松癥是慢性疾病，臨床患者需長期服藥才能在骨組織、骨細(xì)胞中達(dá)到有效的治療濃度，現(xiàn)有靶向技術(shù)也注重將藥物提送至骨細(xì)胞[16]?；谘帩舛鹊慕?jīng)典藥動學(xué)研究不能完全解釋藥物在特定組織(如腫瘤、腦組織等)中的藥理學(xué)作用，或難以真實(shí)預(yù)測藥物的藥效[17]。藥物通常須穿透多重生物屏障，且與細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)結(jié)合而發(fā)揮藥效。2013年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎頒發(fā)給了研究“細(xì)胞內(nèi)分子運(yùn)輸調(diào)節(jié)機(jī)制”的學(xué)者，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸調(diào)控是重大科學(xué)問題，細(xì)胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控也同樣重要[18]。

骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的根本原因是骨吸收和骨形成動態(tài)平衡失調(diào)[19]。其中，骨形成是由OB介導(dǎo)的骨合成代謝活動，OB移行至被吸收陷窩部位，分泌骨基質(zhì)，骨基質(zhì)礦化而形成新骨[20]，而MSCs能夠分化成OB和脂肪細(xì)胞(Adipocytes，AC)[21]，且是OB的前體細(xì)胞[22]，如圖2所示。在臨床治療中，促進(jìn)MSCs成骨分化是有助于促進(jìn)骨形成而抗骨質(zhì)疏松的重要手段。藥物發(fā)揮促成骨分化作用，必先透過MSCs細(xì)胞膜，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)處置，與相關(guān)靶點(diǎn)結(jié)合而發(fā)揮藥效。因此，促骨再生藥物透過MSCs膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制、MSCs內(nèi)的處置過程、動態(tài)分布及外排機(jī)制均是影響其促M(fèi)SCs成骨分化的重要因素。

圖1 不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮成分化學(xué)結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系Fig.1 Chemical structure of epimedium flavonoids with different glycosylation number, type or location of and their relationships注：rha: 鼠李糖 (rhamnose)；xyl：木糖 (xylose)；glc：葡萄糖 (glucose)

圖2 骨細(xì)胞參與的骨吸收及骨形成機(jī)制示意圖Fig.2 Diagram of bone resorption and formation mechanism

3 糖基數(shù)量/種類/位置影響淫羊藿黃酮的生物藥劑學(xué)性質(zhì)及膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

研究表明，淫羊藿素結(jié)構(gòu)中不含有糖基，屬于難溶性藥物，但卻有較好的滲透性[23]。槲皮素苷是槲皮素的糖苷，槲皮素苷的溶解度高于槲皮素，但槲皮素苷的腸吸收透過率顯著低于槲皮素[24]。黃芩苷是在黃芩素的糖苷，黃芩素為不含糖基的苷元，黃芩苷的溶解度是黃芩素的2倍以上，但通過油水分配系數(shù)測定發(fā)現(xiàn)黃芩苷在水溶液的lgP值接近0，黃芩素的lgP值大于2，表明不含糖基的黃芩素較連接糖基的黃芩苷具有更好的滲透性[25]。淫羊藿苷和朝藿定A/B/C分別含有2和3糖基，具有較好的溶解性，但是滲透性較差。寶藿苷I是單糖基黃酮，具有較好的溶解性的同時其滲透性>淫羊藿苷>朝藿定A/B/C[26]。因此，糖基數(shù)量/種類/位置影響淫羊藿黃酮的溶解性和滲透性，且糖基數(shù)量與溶解性呈正相關(guān)、與滲透性呈負(fù)相關(guān)。

圖3 不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮在MSCs上的轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)化機(jī)制示意圖Fig.3 Diagram of transport and transform of epimedium flavonoids with different glycosylation number, type or location in MSCs

朝藿定A、B、C具有相同的糖基數(shù)量(3糖基)，但其糖基種類/位置存在差異，Caco-2細(xì)胞模型研究表明朝藿定A、B、C的滲透性均較差，且有嚴(yán)重的外排現(xiàn)象，朝藿定A和C的外排機(jī)制主要是有P-糖蛋白和乳腺癌耐藥蛋白參與，而朝藿定B的外排機(jī)制只有乳腺癌耐藥蛋白參與[27]。可見，糖基種類/位置影響其膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

4 透膜后的處置過程促進(jìn)淫羊藿黃酮糖基數(shù)量/種類/位置結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化

腸道菌轉(zhuǎn)化研究表明，不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮在腸道菌及其LPH酶的作用下可部分被轉(zhuǎn)化成淫羊藿素，且轉(zhuǎn)化速率為淫羊藿苷>朝藿定B>朝藿定 A>朝藿定 C>寶藿苷I[28]。采用UPLC-Q/TOF-MS技術(shù)解析朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷、淫羊藿苷的處置過程，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)中的糖基數(shù)量/種類/位置均發(fā)生了改變，且朝藿定B、淫羊藿苷、寶藿苷的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程中均能發(fā)現(xiàn)淫羊藿素[5,31]。已有報道，采用UPLC-MS/MS技術(shù)能檢測到淫羊藿素在大鼠脊柱骨中的動態(tài)分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)淫羊藿素在脊柱骨中的半衰期(t1/2)為10.68 h，曲線下面積(area under curve,AUC)為642 hng/g，分布容積(distribution volume,V)為238 683 g/kg，系統(tǒng)清除率(system clearance，CLS)為15 486 g/hkg，平均滯留時間(mean recidence time,MRT)為45.02 h[32]?？梢?，透膜后的處置過程促進(jìn)了淫羊藿黃酮糖基數(shù)量/種類/位置結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。

5 骨細(xì)胞內(nèi)處置過程可促進(jìn)不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮轉(zhuǎn)化成活性更強(qiáng)的黃酮成分

淫羊藿素能促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠骨形成、抑制骨吸收而發(fā)揮很好的抗骨質(zhì)疏松作用[33,34]。環(huán)淫羊藿素能顯著改善骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度、生物力學(xué)性質(zhì)、促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用[35]。研究表明，朝藿定A、B、C、淫羊藿苷、淫羊藿素的抗骨質(zhì)疏松活性強(qiáng)弱順序為：淫羊藿素>淫羊藿苷>朝藿定A、B、C[36]。

有效成分透膜轉(zhuǎn)運(yùn)后與對應(yīng)靶點(diǎn)相互作用而展現(xiàn)出相應(yīng)的藥理活性[37]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMPs)能調(diào)節(jié)MSCs向OB分化，如BMP-2、BMP-4[38]。Runx2是BMP信號通路的下游調(diào)控因子，Runx2也被稱為OB的主要轉(zhuǎn)錄因子，并參與OB成熟過程[39]，BMPs能誘導(dǎo)Runx2表達(dá)，然后進(jìn)一步促進(jìn)MSCs向OB分化和成熟[40]。如圖3所示。

前期研究表明，淫羊藿苷和寶藿苷I均能與BMP-2、BMP-4、Runx2牢固結(jié)合，從而抑制了MSCs向OB細(xì)胞的成骨分化。而淫羊藿素及環(huán)淫羊藿素與BMP-2、BMP-4、Runx2的結(jié)合顯著弱于淫羊藿苷和寶藿苷I，對MSCs向OB細(xì)胞的成骨分化無抑制作用，可表現(xiàn)更強(qiáng)的促成骨分化作用而抗骨質(zhì)疏松，如圖4?？梢?，骨細(xì)胞內(nèi)處置過程可促進(jìn)不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮轉(zhuǎn)化成活性更強(qiáng)的黃酮成分。

圖4 不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮與MSCs細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)相互作用圖Fig.4 Interaction of epimedium flavonoids of different glycosylation number, type or location with intracellular target in MSCs

6 結(jié)語

本課題以細(xì)胞藥代動力學(xué)視角闡述不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮在骨細(xì)胞微環(huán)境的骨再生作用機(jī)制，并推測淫羊藿黃酮結(jié)構(gòu)中不同數(shù)量/種類/位置的糖基影響其溶解性/滲透性，且糖基數(shù)量與溶解性呈正相關(guān)，與滲透性呈負(fù)相關(guān)，糖基種類/位置決定膜轉(zhuǎn)運(yùn)方式，透膜后的胞內(nèi)處置改變了淫羊藿黃酮結(jié)構(gòu)中的糖基數(shù)量/種類/位置，并促進(jìn)其轉(zhuǎn)化為活性更強(qiáng)的黃酮。通過深入探究不同數(shù)量/種類/位置糖基對淫羊藿黃酮在骨細(xì)胞微環(huán)境中的藥物代謝動力學(xué)過程及骨再生作用的影響，可進(jìn)一步闡明淫羊藿黃酮的骨再生作用機(jī)制，開發(fā)靶向制劑，提高藥效并減輕副作用，深入解決骨質(zhì)疏松的治療難題并推動再生藥物的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)醫(yī)學(xué)界的大變革。本課題組后續(xù)將就不同數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮在MSCs的膜吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、胞內(nèi)動態(tài)分布及胞內(nèi)處置，與胞內(nèi)靶點(diǎn)親和力方面進(jìn)行研究，深入探討糖基的數(shù)量/種類/位置對淫羊藿黃酮促M(fèi)SCs成骨分化的重要影響。