程千 魏雅君 蔣俊* 徐希明

1.江蘇大學附屬醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212001 2.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013

再生藥物是當今醫(yī)學領域研究的前沿與熱點，對其再生機制的深入研究將成為人類醫(yī)學史上的一大革命。近年來，眾多研究表明再生藥物能夠通過影響細胞微環(huán)境和(或)細胞信號通路，影響細胞的自我更新能力和定向分化方向，進而體現(xiàn)相應細胞功能[1]，實現(xiàn)組織器官的再生，如加味丹參飲能促進壞死心肌組織心肌特異性蛋白表達，誘導骨髓間充質干細胞向心肌樣細胞分化，促進心肌組織再生[2]；鹿茸多肽能夠抑制成骨樣細胞分泌腫瘤壞死因子TNF和白細胞介素-α，促進軟骨和成骨樣細胞再生[3]等。目前，骨再生因為顯著的代表性、可操作性和實用性，成為了深入研究再生藥物機制的切入點。大量文獻報道不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮(DGEFs)單體均具有基于再生機制的抗骨質疏松作用，但作用強度存在顯著差異，而藥物穿透細胞膜并與細胞內靶點結合是影響其藥效強度的重要環(huán)節(jié)，因此闡述不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮在骨細胞微環(huán)境的藥物代謝動力學是深入解析其骨再生機制的重要研究內容。本文在多年的研究基礎上，結合前期實驗數(shù)據(jù)，提出了全新的假說和研究思路，以期深入闡明不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮抗骨質疏松的科學內涵。

1 不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮(DGEFs)具有基于再生機制的抗骨質疏松作用

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿或朝鮮淫羊藿的干燥葉，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕作用[4]。從淫羊藿中分離得到的化合物超過270種，其中淫羊藿黃酮含量最高[5,7]。這類黃酮成分主要包括，寶藿苷I (Baohuside I)、淫羊藿苷(Icariin)、朝藿定A、B、C(Epimedin A、B、C)[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，朝藿定A、B、C、淫羊藿苷、寶藿苷I經大鼠口服給藥后，在其血清、膽汁或者糞便中能檢測到淫羊藿素(Icaritin)，如此淫羊藿素也不可忽視地成為來源于淫羊藿的重要活性成分。這些黃酮類化合物以淫羊藿素為母核，選擇性地在C-7位連接葡萄糖(glucose，glc)或者在C-3位連接不同數(shù)量的鼠李糖(rhamnose，rha)、glc、木糖(xylose,xyl)。此外，淫羊藿素還有一個同分異構體苷元-環(huán)淫羊藿素(C-icaritin)[5]。這些黃酮成分化學結構及其相互關系如圖1所示。

研究發(fā)現(xiàn)，朝藿定B、淫羊藿苷、寶藿苷I能夠促進雌激素依賴的成骨細胞(osteoblast,OB)活力而發(fā)揮骨保護作用[9,10]；朝藿定B、淫羊藿苷、寶藿苷I能刺激OB形成，抑制骨質疏松小鼠破骨細胞分化[11]。淫羊藿總黃酮及其中所含淫羊藿苷和寶藿苷I能調節(jié)破骨細胞形成及其活性，抑制破骨細胞的分化和骨吸收[12]; 淫羊藿總黃酮還能促進骨間質干細胞(mesenchyma stem cells，MSCs)的成骨分化，促進骨再生和修復功能[13]。淫羊藿總黃酮及微量的淫羊藿苷和朝藿定 B能對抗?jié)娔崴升堈T導的斑馬魚骨質疏松[14,15]。因此，淫羊藿黃酮是通過促進MSCs的成骨性分化和OB的分化成熟，抑制破骨細胞的分化和骨吸收活性，實現(xiàn)骨再生的，在骨質疏松治療方面具有重要的研究價值和應用前景。

2 在骨細胞微環(huán)境的藥代動力學過程是淫羊藿黃酮發(fā)揮促骨再生作用的關鍵

骨質疏松癥是慢性疾病，臨床患者需長期服藥才能在骨組織、骨細胞中達到有效的治療濃度，現(xiàn)有靶向技術也注重將藥物提送至骨細胞[16]?；谘帩舛鹊慕浀渌巹訉W研究不能完全解釋藥物在特定組織(如腫瘤、腦組織等)中的藥理學作用，或難以真實預測藥物的藥效[17]。藥物通常須穿透多重生物屏障，且與細胞內靶點結合而發(fā)揮藥效。2013年諾貝爾生理醫(yī)學獎頒發(fā)給了研究“細胞內分子運輸調節(jié)機制”的學者，細胞內物質運輸調控是重大科學問題，細胞內藥物轉運調控也同樣重要[18]。

骨質疏松癥發(fā)病的根本原因是骨吸收和骨形成動態(tài)平衡失調[19]。其中，骨形成是由OB介導的骨合成代謝活動，OB移行至被吸收陷窩部位，分泌骨基質，骨基質礦化而形成新骨[20]，而MSCs能夠分化成OB和脂肪細胞(Adipocytes，AC)[21]，且是OB的前體細胞[22]，如圖2所示。在臨床治療中，促進MSCs成骨分化是有助于促進骨形成而抗骨質疏松的重要手段。藥物發(fā)揮促成骨分化作用，必先透過MSCs細胞膜，經細胞內處置，與相關靶點結合而發(fā)揮藥效。因此，促骨再生藥物透過MSCs膜轉運機制、MSCs內的處置過程、動態(tài)分布及外排機制均是影響其促MSCs成骨分化的重要因素。

圖1 不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮成分化學結構及其相互關系Fig.1 Chemical structure of epimedium flavonoids with different glycosylation number, type or location of and their relationships注：rha: 鼠李糖 (rhamnose)；xyl：木糖 (xylose)；glc：葡萄糖 (glucose)

圖2 骨細胞參與的骨吸收及骨形成機制示意圖Fig.2 Diagram of bone resorption and formation mechanism

3 糖基數(shù)量/種類/位置影響淫羊藿黃酮的生物藥劑學性質及膜轉運機制

研究表明，淫羊藿素結構中不含有糖基，屬于難溶性藥物，但卻有較好的滲透性[23]。槲皮素苷是槲皮素的糖苷，槲皮素苷的溶解度高于槲皮素，但槲皮素苷的腸吸收透過率顯著低于槲皮素[24]。黃芩苷是在黃芩素的糖苷，黃芩素為不含糖基的苷元，黃芩苷的溶解度是黃芩素的2倍以上，但通過油水分配系數(shù)測定發(fā)現(xiàn)黃芩苷在水溶液的lgP值接近0，黃芩素的lgP值大于2，表明不含糖基的黃芩素較連接糖基的黃芩苷具有更好的滲透性[25]。淫羊藿苷和朝藿定A/B/C分別含有2和3糖基，具有較好的溶解性，但是滲透性較差。寶藿苷I是單糖基黃酮，具有較好的溶解性的同時其滲透性>淫羊藿苷>朝藿定A/B/C[26]。因此，糖基數(shù)量/種類/位置影響淫羊藿黃酮的溶解性和滲透性，且糖基數(shù)量與溶解性呈正相關、與滲透性呈負相關。

圖3 不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮在MSCs上的轉運轉化機制示意圖Fig.3 Diagram of transport and transform of epimedium flavonoids with different glycosylation number, type or location in MSCs

朝藿定A、B、C具有相同的糖基數(shù)量(3糖基)，但其糖基種類/位置存在差異，Caco-2細胞模型研究表明朝藿定A、B、C的滲透性均較差，且有嚴重的外排現(xiàn)象，朝藿定A和C的外排機制主要是有P-糖蛋白和乳腺癌耐藥蛋白參與，而朝藿定B的外排機制只有乳腺癌耐藥蛋白參與[27]。可見，糖基種類/位置影響其膜轉運機制。

4 透膜后的處置過程促進淫羊藿黃酮糖基數(shù)量/種類/位置結構轉化

腸道菌轉化研究表明，不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮在腸道菌及其LPH酶的作用下可部分被轉化成淫羊藿素，且轉化速率為淫羊藿苷>朝藿定B>朝藿定 A>朝藿定 C>寶藿苷I[28]。采用UPLC-Q/TOF-MS技術解析朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷、淫羊藿苷的處置過程，發(fā)現(xiàn)其結構中的糖基數(shù)量/種類/位置均發(fā)生了改變，且朝藿定B、淫羊藿苷、寶藿苷的吸收轉運過程中均能發(fā)現(xiàn)淫羊藿素[5,31]。已有報道，采用UPLC-MS/MS技術能檢測到淫羊藿素在大鼠脊柱骨中的動態(tài)分布，結果發(fā)現(xiàn)淫羊藿素在脊柱骨中的半衰期(t1/2)為10.68 h，曲線下面積(area under curve,AUC)為642 hng/g，分布容積(distribution volume,V)為238 683 g/kg，系統(tǒng)清除率(system clearance，CLS)為15 486 g/hkg，平均滯留時間(mean recidence time,MRT)為45.02 h[32]?？梢姡改ず蟮奶幹眠^程促進了淫羊藿黃酮糖基數(shù)量/種類/位置結構轉化。

5 骨細胞內處置過程可促進不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮轉化成活性更強的黃酮成分

淫羊藿素能促進骨質疏松大鼠骨形成、抑制骨吸收而發(fā)揮很好的抗骨質疏松作用[33,34]。環(huán)淫羊藿素能顯著改善骨質疏松大鼠的骨密度、生物力學性質、促進骨形成、抑制骨吸收而發(fā)揮抗骨質疏松作用[35]。研究表明，朝藿定A、B、C、淫羊藿苷、淫羊藿素的抗骨質疏松活性強弱順序為：淫羊藿素>淫羊藿苷>朝藿定A、B、C[36]。

有效成分透膜轉運后與對應靶點相互作用而展現(xiàn)出相應的藥理活性[37]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMPs)能調節(jié)MSCs向OB分化，如BMP-2、BMP-4[38]。Runx2是BMP信號通路的下游調控因子，Runx2也被稱為OB的主要轉錄因子，并參與OB成熟過程[39]，BMPs能誘導Runx2表達，然后進一步促進MSCs向OB分化和成熟[40]。如圖3所示。

前期研究表明，淫羊藿苷和寶藿苷I均能與BMP-2、BMP-4、Runx2牢固結合，從而抑制了MSCs向OB細胞的成骨分化。而淫羊藿素及環(huán)淫羊藿素與BMP-2、BMP-4、Runx2的結合顯著弱于淫羊藿苷和寶藿苷I，對MSCs向OB細胞的成骨分化無抑制作用，可表現(xiàn)更強的促成骨分化作用而抗骨質疏松，如圖4。可見，骨細胞內處置過程可促進不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮轉化成活性更強的黃酮成分。

圖4 不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮與MSCs細胞內靶點相互作用圖Fig.4 Interaction of epimedium flavonoids of different glycosylation number, type or location with intracellular target in MSCs

6 結語

本課題以細胞藥代動力學視角闡述不同糖基數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮在骨細胞微環(huán)境的骨再生作用機制，并推測淫羊藿黃酮結構中不同數(shù)量/種類/位置的糖基影響其溶解性/滲透性，且糖基數(shù)量與溶解性呈正相關，與滲透性呈負相關，糖基種類/位置決定膜轉運方式，透膜后的胞內處置改變了淫羊藿黃酮結構中的糖基數(shù)量/種類/位置，并促進其轉化為活性更強的黃酮。通過深入探究不同數(shù)量/種類/位置糖基對淫羊藿黃酮在骨細胞微環(huán)境中的藥物代謝動力學過程及骨再生作用的影響，可進一步闡明淫羊藿黃酮的骨再生作用機制，開發(fā)靶向制劑，提高藥效并減輕副作用，深入解決骨質疏松的治療難題并推動再生藥物的發(fā)展，實現(xiàn)醫(yī)學界的大變革。本課題組后續(xù)將就不同數(shù)量/種類/位置淫羊藿黃酮在MSCs的膜吸收轉運、胞內動態(tài)分布及胞內處置，與胞內靶點親和力方面進行研究，深入探討糖基的數(shù)量/種類/位置對淫羊藿黃酮促MSCs成骨分化的重要影響。