劉銳 楊小杰 李鑫 張超 高秋明

蘭州軍區(qū)總醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，甘肅 蘭州 730050

補(bǔ)骨脂為豆科補(bǔ)骨脂屬植物補(bǔ)骨脂(Psoralea corylifolia L．)的干燥成熟果實(shí)， 為《中國藥典》收載的傳統(tǒng)中藥。中藥補(bǔ)骨脂，別名和蘭莧、胡韭子，其性溫、味辛，具有補(bǔ)腎助陽，溫中止瀉，納氣平喘之功。其中主要活性成分補(bǔ)骨脂素(psoralen)和異補(bǔ)骨脂素(isopsoralen)等香豆素類成分，具有較強(qiáng)的光敏化作用和鎮(zhèn)靜、解痙、止血等作用，是治療白癜風(fēng)、斑禿、牛皮癬以及瘤樣皮膚病的有效藥物[1]。近來研究表明，異補(bǔ)骨脂素具有與雌激素類似的促進(jìn)骨代謝效果，可控制機(jī)體的骨量流失狀態(tài)從而達(dá)到治療因骨量流失引起的骨質(zhì)疏松癥。因此，研究異補(bǔ)骨脂素對骨質(zhì)疏松的治療作用具有重要意義。本文旨在研究異補(bǔ)骨脂素對去卵巢大鼠骨代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

3月齡SPF級雌性SD大鼠40只，購自中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號：SCXK軍2010-007。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

主要試劑：異補(bǔ)骨脂素(中國藥品生物制品檢定所，含量測定用，批號為110738-201509)。水合氯醛(天津大茂化學(xué)試劑公司)，鈣黃綠素(美國Sigma公司)，四環(huán)素(美國Sigma公司)，苯甲酸雌二醇(中國美侖生物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)，甲基丙烯酸甲酯(天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司，中國)，鄰苯二甲酸二丁酯(煙臺(tái)市雙雙化工有限公司，中國)，過氧化苯甲酰(上海山浦化工有限公司，中國)，無水乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，中國)，二甲苯(天津市巴斯夫化工有限公司，中國)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自北京中杉金橋公司。

主要實(shí)驗(yàn)儀器有：主要儀器雙能X線骨密度儀(GE 公司，美國)， 正置相差顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)，SP1600 硬組織切片機(jī)(LEICA 公司，德國)，SB-5200DT 超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司，中國)，便攜式真空泵，Image-ProPlus6.0(IPP6.0)Media Cybernetics，公司圖片分析軟件。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及處理： 3周齡SPF級雌性SD大鼠40只，由中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK軍2010-007。將大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為假手術(shù)組，模型組，異補(bǔ)骨脂素組和雌激素處理組(苯甲酸雌二醇0.2 mg/kg，皮下注射，每周1次)[2]。去卵巢大鼠模型的建立及藥物處理： 3月齡雌性SD大鼠40只，體重210～230 g，10只作為假手術(shù)對照組，30只經(jīng)腹手術(shù)雙側(cè)去卵巢后隨機(jī)分為3組，分別為模型組，異補(bǔ)骨脂素組和雌二醇陽性對照組。除陽性對照組外，各組分別于去卵巢后6w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理，異補(bǔ)骨脂素組每天用25 mg /kg灌胃1次，1周停1天；模型組，與藥物組等體積生理鹽水灌胃處理；假手術(shù)組不作處理。去卵巢雌二醇陽性對照組，手術(shù)當(dāng)天按0.2 mg/kg體重皮下注射苯甲酸雌二醇1次，此后每周1次。飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，濕度60%～70%，飲用自來水，標(biāo)準(zhǔn)類飼料，不限制飲水和食量，所有大鼠隨機(jī)分組后安置在塑料筐內(nèi)。

1.3.2 骨密度及生物力學(xué)檢測：藥物灌胃處理第12周時(shí)，采用100 g/L 的水合氯醛，在實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔注射3 mL/kg進(jìn)行麻醉。將麻醉后的大鼠置于雙能X線骨密度儀下檢測其全身骨密度，后處死大鼠，分離股骨和椎體骨組織，分別置于雙能X線骨密度儀下檢測離體骨密度，生物力學(xué)檢測。

1.3.3 骨形態(tài)分析：第12周處死動(dòng)物，于處死前第14、13天及第4、3天分別皮下注射25 mg/kg四環(huán)素(美國Sigma公司)和5 mg/kg鈣黃綠素(美國Sigma公司)作雙熒光標(biāo)記。大鼠處死后：取左脛骨用低速鋸(Buehler LTD，USA)將其分為3段，其上段行額狀面去掉脛骨粗隆后置70%酒精中固定24 h，經(jīng)酒精脫水后，用甲基丙烯酸甲酯進(jìn)行不脫鈣骨包埋，并切成5μm薄片及l(fā)0μm厚片，厚片觀察骨小梁骨量及組織結(jié)構(gòu)，薄片脫鈣后，行HE染色觀察骨組織細(xì)胞[3]。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)：①靜態(tài)指標(biāo)：骨小梁面積百分率，骨小梁寬度，骨小梁數(shù)量，骨小梁分離度。②反映破骨的動(dòng)力學(xué)指標(biāo)：破骨細(xì)胞數(shù)，骨小梁周長破骨細(xì)胞數(shù)。

1.3.4 血清ELISA檢測：大鼠心臟取血，5000 r/min，離心15 min，留血清，-80℃保存；ELISA試劑盒對血清中骨鈣素(osteocalcin，OC) 和抗酒石酸性磷酸酶5b(tartrate resistant acid phosphatase 5b，TRACP 5b)檢測，標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及樣品測定方法按照說明書操作；于酶標(biāo)儀上405 nm和450 nm處測定OD值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每孔中的TRACP 5b和OC的量。并用Image-ProPlus6.0(IPP6.0)圖片分析軟件進(jìn)行骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析。

1.3.5 離體骨免疫組織切片及組織化學(xué)染色：組織切片：方法見參考文獻(xiàn)[4]，取1.5 cm×1 cm×0.5 cm大小的骨組織，放入4% 中性緩沖甲醛液4℃固定24 h，然后入中性EDTA脫鈣液(4℃冰箱內(nèi))脫鈣，每3天換1次脫鈣液，約2w后用大頭針刺探脫鈣骨標(biāo)本，若能穿入骨密質(zhì)即可流水沖洗，然后經(jīng)70%乙醇1.5 h，80% 乙醇1.5 h，95% 乙醇1 h，無水乙醇I 30 min，無水乙醇Ⅱ 30 min；二甲苯I 20 min，二甲苯Ⅱ 20 min；浸蠟(58～60℃)l h，石蠟包埋，制成蠟塊，切成4 μm厚的石蠟切片，60℃溫箱烤片1 h后再行染色。免疫組化染色：方法見參考文獻(xiàn)[5]，石蠟切片脫蠟至蒸餾水，3% H202，甲醇液室溫作用20 min后水洗；切片入1% 胃蛋白酶37 ℃孵育10 min；滴加50μL BSA，室溫封閉20 min后甩干；滴加鼠抗BMP-2多克隆抗體4℃濕盒孵育過夜；PBS洗，滴加 Biotin 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 37℃濕盒孵育40min；PBS洗，滴加HRP標(biāo)記的鏈霉親和素分子37℃濕盒孵育30min；PBS洗，DAB/H202顯色；自來水充分洗滌，蒸餾水洗；蘇木精1min，水洗，1% 鹽酸酒精分化后返藍(lán)；蒸餾水洗后，梯度酒精徹底脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 骨密度測量及生物力學(xué)檢測

骨密度測量及生物力學(xué)檢測結(jié)果見表1、2。

表1 大鼠全身骨密度、股骨骨密度、椎骨骨密度測量結(jié)果(g/cm2，±s)Table 1 Results of whole body bone mineral density, femoral bone mineral density, and vertebral bone mineral density(g/cm2，±s)

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

表2 大鼠彈性模量、最大載荷、屈服強(qiáng)度測量結(jié)果Table 2 Results of elastic modulus, maximum load, and yield strength in rats

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.2 血清ELISA檢測

血清ELISA檢測見圖1、2。

圖1 血清中TRACP 5b的ELISA檢測結(jié)果注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01Fig.1 The test results of serum TRACP 5b

圖2 血清中OC的 ELISA檢測結(jié)果注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01Fig.2 The test results of serum OC

2.3 免疫組織化學(xué)染色圖片

免疫組化切片具有陽性結(jié)果，呈顆粒狀或條塊狀的棕黃色(見圖3、4)，定位準(zhǔn)確，對比明顯，背景淺，骨小梁結(jié)構(gòu)完整、清晰，染色結(jié)果穩(wěn)定可靠，敏感性高、特異性強(qiáng)，適合顯微照相等。因此，該方法可作為骨組織的制片與免疫組化的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)用。

圖3 OPG免疫組織化學(xué)染色A為模型對照組，B為藥物處理組，C為陽性對照組，D為假手術(shù)組Fig.3 Immunohistochemical staining for OPGA. model control group; B. drug treatment group; C. positive control group; D. sham operation group

圖4 RANKL免疫組織化學(xué)染色A為模型對照組，B為藥物處理組，C為陽性對照組，D為假手術(shù)組Fig.4 Immunohistochemical staining for RANKLA. model control group; B. drug treatment group; C. positive control group; D. sham operation group

大鼠去卵巢后骨組織OPG表達(dá)迅速下降，而RANKL表達(dá)明顯升高，由圖3所示：與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠骨組織OPG表達(dá)顯著升高；與模型組比較，異補(bǔ)骨脂素組大鼠骨組織OPG表達(dá)極顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。異補(bǔ)骨脂素組與陽性對照相比無統(tǒng)計(jì)差異。由圖4所示：假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠骨組織RANKL表達(dá)較高；與模型組比較，異補(bǔ)骨脂素組大鼠骨組織RANKL表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。異補(bǔ)骨脂素組與陽性對照相比無統(tǒng)計(jì)差異。

3 討論

眾所周知，絕經(jīng)后婦女雌激素缺乏導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，雌激素替代療法是當(dāng)前常用抗骨質(zhì)疏松藥物，考慮到其副作用，如何尋找安全的抗骨質(zhì)疏松藥物就變成當(dāng)務(wù)之急[6]。異補(bǔ)骨脂素作為補(bǔ)陽壯骨的天然化合物在骨研究領(lǐng)域得到眾多的關(guān)注，苯甲酸雌二醇，是公認(rèn)的抗骨質(zhì)疏松藥物。大鼠雙側(cè)卵巢切除是常用的絕經(jīng)后骨量丟失模型。

本試驗(yàn)中，假手術(shù)組全身、股骨和腰椎骨密度均極顯著高于模型組，說明去卵巢大鼠是研究骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制的良好模型。異補(bǔ)骨脂素與苯甲酸雌二醇體質(zhì)量均高于模型組，對臟器濕質(zhì)量無顯著性影響。TRACP 5b 是破骨細(xì)胞分泌的特異性酶，OC 是成骨細(xì)胞分泌的特異性酶，異補(bǔ)骨脂素顯著影響血清TRACP 5b 和OC的水平，表明能促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收。OPG、RANKL均可由成骨細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，幾乎所有重要的骨代謝相關(guān)激素和細(xì)胞因子均可以通過調(diào)節(jié)OPG和RANKL的表達(dá)發(fā)揮調(diào)節(jié)骨重建的作用。雌激素缺乏導(dǎo)致的多種細(xì)胞因子分泌異常是導(dǎo)致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的重要原因[7]。試驗(yàn)中，我們觀察到大鼠去卵巢后股骨成骨細(xì)胞OPG表達(dá)迅速下降，而RANKL表達(dá)明顯升高，OPG/RANKL比值前期明顯低于對照組，其結(jié)果和曾天舒等[8]報(bào)道的大鼠去卵巢后骨髓源性破骨細(xì)胞形成在后期達(dá)到高峰相一致。去卵巢后立即給予雌激素可以使上述基因表達(dá)的異?；謴?fù)到接近正常水平[9]?？诜愌a(bǔ)骨脂素，注射苯甲酸雌二醇后，骨小梁數(shù)量有所增多，交聯(lián)度致密，同時(shí)異補(bǔ)骨脂素組股骨生物力學(xué)、腰椎彈性模量、強(qiáng)度增加與骨組織微結(jié)構(gòu)的改善有關(guān)。異補(bǔ)骨脂素組骨密度、生化指標(biāo)、骨形態(tài)和生物力學(xué)平均值略低于陽性對照組，異補(bǔ)骨脂素組增高的骨密度可能與其較高的骨鈣素表達(dá)、較強(qiáng)消退炎癥反應(yīng)能力有關(guān)，意味著較強(qiáng)的骨形成、抑制骨吸收能力使得其骨密度和骨微結(jié)構(gòu)強(qiáng)勢。異補(bǔ)骨脂素作用機(jī)制可能與扭轉(zhuǎn)骨轉(zhuǎn)換、消退炎癥反應(yīng)、活躍血管再生途徑有關(guān)。王建華和翟遠(yuǎn)坤等[10,11]研究了異補(bǔ)骨脂素對體外大鼠成骨細(xì)胞增殖與分化的影響，然而異補(bǔ)骨脂素是如何作用于機(jī)體，如何被吸收，如何發(fā)揮其藥理作用，如何參與細(xì)胞信號通路？未見報(bào)道，所以，如何進(jìn)一步了解異補(bǔ)骨脂素作用的分子機(jī)理有待更深層次的研究。