王飆 趙和平 高文杰 李鑫 梅洋 喬蓉 騫雨 王冀邯*

1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會(huì)醫(yī)院，陜西 西安 710054 2.電信科學(xué)技術(shù)第十研究所，陜西 西安 710000

隨著人口老齡化的到來，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis, OP)在中老年人群的發(fā)病率不斷增加[1]。充分認(rèn)識(shí)骨質(zhì)疏松癥對(duì)早期預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松性骨折等并發(fā)癥的發(fā)生具有積極的臨床意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調(diào)與骨代謝異常有一定的相關(guān)性[2]。然而，骨質(zhì)疏松患者腸道菌群結(jié)構(gòu)與功能是如何改變的尚不明確。本研究基于新一代測(cè)序技術(shù)，對(duì)細(xì)菌16S rRNA高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序，以分析原發(fā)性O(shè)P患者腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化，探討原發(fā)性O(shè)P腸道菌群的多樣性信息。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

研究選取2016年5月至8月西安市紅會(huì)醫(yī)院收治的門診或住院原發(fā)性骨質(zhì)疏松患者7例及健康對(duì)照組7例，采集受試者新鮮糞便，迅速放入冰盒后轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃儲(chǔ)存。受試者無合并胃腸道、高血壓、糖尿病等其他系統(tǒng)性疾病。要求受試對(duì)象采集標(biāo)本前一周未服用抗生素、類固醇藥物，未服用中草藥制劑，未服用微生態(tài)制劑、酸奶等益生菌。

1.2 糞便腸道菌群DNA提取

依據(jù)糞便腸道菌群DNA提取試劑盒QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(QIAGEN)操作說明書進(jìn)行樣本DNA提取。用紫外分光光度計(jì)(NanoDrop)檢測(cè)DNA濃度及純度，1%瓊脂糖凝膠電泳跑膠觀察DNA完整性。選取OD260/OD280值在1.8～2.0之間、條帶完整的DNA樣本進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3 16S rRNA PCR擴(kuò)增及Illumina測(cè)序

采用TransGen AP221-02(TransGen)試劑對(duì)細(xì)菌16S rRNA的V3、V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，所用引物為：338F, 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；806R, 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。擴(kuò)增體系為：5×FastPfu Buffer 4 μL、2.5 mM dNTPs 2 μL、Forward Primer (5 μM) 0.8 μL、Reverse Primer (5 μM) 0.8 μL、FastPfu Polymerase 0.4 μL、BSA 0.2 μL、Template DNA 10 ng、補(bǔ)充ddH2O至20 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 3分鐘；95 ℃ 30秒、55 ℃ 30秒、72 ℃ 45秒(27次循環(huán))；72 ℃ 10分鐘。使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN)切膠回收PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega)進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。運(yùn)用Illumina平臺(tái)構(gòu)建文庫，Illumina MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用I-Sanger生物數(shù)據(jù)分析平臺(tái)進(jìn)行菌群多樣性分析。包含五個(gè)分析模塊：測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控，物種注釋與評(píng)估，Alpha多樣性，Beta多樣性，物種差異分析。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

本研究收錄的原發(fā)性骨質(zhì)疏松患者7例全部為女性，年齡61～73歲，平均年齡(68.20±5.02)歲；對(duì)照組7例全部為女性，年齡59～71歲，平均年齡(66.80±4.60)歲。兩組人群性別、年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.2 樣本腸道菌群的物種注釋

采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTUs (Operational Taxonomic Units, 分類操作單位)代表序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對(duì)獲取分類學(xué)信息，并分別在界(kingdom)、門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)、種(species)、分類操作單位(OTUs)分類水平上統(tǒng)計(jì)樣本的群落種類數(shù)目。結(jié)果如表1所示。可以看出，隨著分類級(jí)別由高到低，骨質(zhì)疏松組在綱、目、科、屬、種、OTUs水平的群落種類數(shù)目要多于對(duì)照組。圖1展示了兩組樣本分別在門、科、種、OTUs水平的韋恩圖(Venn圖)，提示兩組樣本在不同層次的分類水平中均有一定的重疊性，且在重疊的菌群之外，骨質(zhì)疏松組含有的特異性菌群類別要多于對(duì)照組。

表1 不同分類水平下物種個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Bacterial taxonomy at different levels

2.3 兩組樣本腸道菌群多樣性分析

圖1 樣本在門、科、種、OTUs分類水平的韋恩圖Fig.1 Venn diagram at different levels注：圖中綠色圓圈代表骨質(zhì)疏松組，紅色圓圈代表對(duì)照組。圓圈之間的重疊區(qū)域代表兩組樣本共有的菌群物種。Note: The green circle represents the osteoporosis group, and the red circle represents the control group. The overlap of the two circles represents common microbial flora species of the two groups.

Alpha多樣性是指一個(gè)特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，常用的度量標(biāo)準(zhǔn)有chao1 estimator(趙氏指數(shù))、shannon estimator(香農(nóng)指數(shù))、ace index(艾森指數(shù))、simpson index(辛普森指數(shù))等，可以反映物種的多樣性豐度信息[3]。運(yùn)用組間T檢驗(yàn)的方法，得出趙氏指數(shù)及艾森指數(shù)在兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，香農(nóng)指數(shù)及辛普森指數(shù)在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2所示。Beta多樣性能夠評(píng)估微生物群落間的差異，運(yùn)用unifrac距離算法對(duì)距離矩陣進(jìn)行層級(jí)聚類(hcluster)可以清楚的看出樣本分支的距離遠(yuǎn)近[4]。圖3展示了兩組樣本在OTUs水平的聚類樹，提示通過聚類可以將骨質(zhì)疏松組與對(duì)照組樣本進(jìn)行區(qū)分。

表3 組間物種差異性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)表Table 3 Significance of bacterial community abundance

注：此表比較的是兩組樣本在不同分類水平所含有的物種數(shù)目占該分類水平下總物種數(shù)目的百分值

Note: Comparison of the proportions of species at different levels

表2 組間T檢驗(yàn)數(shù)據(jù)表Table 2 T test of estimators in alpha diversity

圖2 樣本在OTUs分類水平的層級(jí)聚類圖Fig.2 Hierarchical clustering tree at OTUs level

2.4 兩組樣本腸道菌群物種差異分析

運(yùn)用Wilcox秩和檢驗(yàn)對(duì)骨質(zhì)疏松組、對(duì)照組得到的菌群進(jìn)行組間差異顯著性分析。表3展示了兩組樣本分別在門(phylum)、科(family)、種(species)分類水平的物種差異檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥臨床上主要表現(xiàn)為腰背疼和病理性骨折，是一種以骨量降低和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征、骨的脆性增加和易于骨折為特點(diǎn)的一種代謝性骨病[5]。近年來，數(shù)個(gè)團(tuán)隊(duì)報(bào)道了腸道菌群失衡與骨質(zhì)代謝的相關(guān)性[6,7]。然而，迄今為止尚無報(bào)道揭示骨質(zhì)疏松癥患者腸道菌群的多樣性信息。

目前人們對(duì)于樣本中微生物菌群組成的了解主要依賴于傳統(tǒng)培養(yǎng)、顯微鏡檢以及細(xì)菌分離物的發(fā)酵和生化特點(diǎn)等方法。然而，來自患者糞便樣本中絕大多數(shù)的腸道菌群不能經(jīng)常規(guī)的分離培養(yǎng)獲得，導(dǎo)致菌群多樣性基因資源難以被發(fā)現(xiàn)。16S rRNA基因作為是細(xì)菌鑒定的黃金標(biāo)準(zhǔn)(gold standard)，被稱為微生物系統(tǒng)分類研究中最有用和最常用的“分子鐘”[8]。在此研究中，我們對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因中的V3、V4可變區(qū)進(jìn)行基因擴(kuò)增、測(cè)序。研究結(jié)果表明腸道菌群多樣性分析能夠有效地將骨質(zhì)疏松組與對(duì)照組進(jìn)行鑒別區(qū)分，且骨質(zhì)疏松組腸道菌群在綱、目、科、屬、種、OTUs層次的菌群種類要多于對(duì)照組。大多數(shù)菌群在兩組人群中同時(shí)存在，少數(shù)菌群為骨質(zhì)疏松組及對(duì)照組所特有，且對(duì)照組特異性菌群種類明顯少于骨質(zhì)疏松組特異性菌群。樣本腸道菌群物種差異分析提示骨質(zhì)疏松組與對(duì)照組在門、科、種等分類水平上的菌群存在差異，差異主要表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松組中的部分菌群含量要高于對(duì)照組。

綜上，該研究以原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥為研究對(duì)象，通過細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增、測(cè)序、生物信息學(xué)分析，探討了疾病狀態(tài)下的腸道菌群多樣性特征。然而，樣本量小為該研究的一大不足，更大樣本量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究有待進(jìn)一步開展，為研究腸道菌群與骨質(zhì)代謝之間的關(guān)系提供理論依據(jù)。