喻鈞倫 唐曦 肖文 黃雨 羅天友* 吳少平*

1.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院放射科，重慶 400016 2.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院放射科，四川 成都 610500

激素性股骨頭壞死屬于股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head, ANFH)的一種，其發(fā)生機制涉及多種因素，既往認為激素在體內長期蓄積造成血液粘稠度增加，血脂增高，脂肪栓塞，造成骨的微細血管阻塞，以及骨質合成減少，鈣質吸收障礙，發(fā)生骨質疏松及微細骨折，最后導致股骨頭缺血壞死[1,4]。隨著激素在臨床中的廣泛使用，激素性股骨頭壞死的發(fā)病率也越來越高，是嚴重危害人類健康的慢性病[3]。

激素性股骨頭壞死早期股骨頭壞死區(qū)域少，變形小，治療效果較好[3,4]，目前包括物理、藥物治療及外科手術等多種治療技術[4,6]，在激素性股骨頭壞死的早期治療有積極效應，但遠期效果并不理想。因此，尋找積極有效的干預措施，防治早期股骨頭缺血壞死的發(fā)生及發(fā)展是國內外關注的焦點。

正常股骨頭內存在肽能神經元，股骨頭壞死后感覺神經損傷，調節(jié)骨內微循環(huán)的神經肽分泌減少，可導致破骨與成骨活動失衡，破骨細胞作用增強，骨細胞死亡，骨礦物質含量降低，從而使骨形成減弱，造成骨質疏松、骨小梁細微骨折等嚴重后果，故股骨頭神經內分泌與骨內微循環(huán)相關研究漸受重視[7,8]。

1993年Lin[9,12]提出從大鼠神經膠質細胞系B49的培養(yǎng)液提純并命名——膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子，屬于轉化生長因子β超家族成員之一。GDNF在體內分布廣泛，對神經系統(tǒng)的發(fā)育、生長、損傷及修復過程中都具有重要神經營養(yǎng)作用[9,12]。GDNF應用于股骨頭壞死動物模型的研究目前尚無報道，故我們假設，股骨頭壞死發(fā)生后，GDNF可否通過對受損的神經進行營養(yǎng)、修復，改變其內部微循環(huán)系統(tǒng)，從而達到調節(jié)骨質形成、穩(wěn)定骨小梁的目的。

綜上，本實驗利用GDNF干預早期激素性股骨頭壞死兔模型，探討GDNF對激素性股骨頭壞死的保護作用，并為激素性股骨頭壞死的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級新西蘭大白兔購于成都達碩生物科技有限公司；GDNF購于美國RICKY公司；SOMATOM Definition AS+64排螺旋CT出自德國SIEMENS公司，顯微CT出自廣州中科愷盛醫(yī)療科技有限公司，組織切片機出自美國Thermo Scientific公司，正置顯微鏡出自德國Lecia公司。

1.2 方法

1.2.1 建立動物模型:SPF級新西蘭大白兔，雄性，10月齡，單籠飼養(yǎng)，自由飲水，標準顆粒飼料喂養(yǎng)。經成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院動物倫理學委員會批準，按動物實驗3R原則給予人道關懷。適應性喂養(yǎng)1周后，采用激素聯(lián)合脂多糖改良技術建立激素性股骨頭壞死兔模型[13]。建模第1、2周，隨機選取1只處死，取股骨頭組織作病理學觀察，驗證是否發(fā)生壞死。

骨壞死診斷標準為：骨小梁內見彌漫性骨細胞空陷窩或核皺縮，伴有周圍骨髓細胞壞死[14]。

1.2.2 藥物干預：建模完成后，采用數(shù)字表法隨機分組并標記，分為實驗組(n=12)、對照組(n=12)。實驗組給予髖周肌肉注射GDNF(8.0 μg/只)，對照組相同部位注射等體積生理鹽水，干預1周。分別于第5、10、15、20 天兩組各隨機選取3只，依次進行以下指標的觀察。

1.2.3 螺旋CT掃描：采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(4.0 mL/kg)新西蘭大白兔，行64排螺旋CT掃描，俯臥位，選用成人胸骨序列，0.6 mm骨重建算法掃描雙髖關節(jié)，由兩名醫(yī)師共同閱片，觀察兔股骨頭形態(tài)及骨質密度等影像學表現(xiàn)。

1.2.4 顯微CT掃描：采用空氣栓塞法處死新西蘭大白兔，解剖出股骨頭，行顯微CT掃描，冠狀位，管電壓60 kvp，功率40 W，電流0.67 mA。CT閾值切割取225～700 HU的全骨組織[15]，感興趣區(qū)選擇骨皮質下與骺板之間，半徑為1.0～1.5 mm的圓形區(qū)域。觀察骨小梁的形態(tài)、分布，骨皮質厚度，并測定骨礦物質密度(bone mineral density, BMD)、組織礦物質密度(tissue mineral density, TMD)、骨體積分數(shù)(bone volume/total volume, BV/TV)值。

1.2.5 H&E染色：骨組織標本經4.0%多聚甲醛固定48小時，酸性脫鈣液脫鈣36小時。冠狀位取材，梯度乙醇脫水，浸蠟，包埋，作4.0 μm切片，H&E染色后正置顯微鏡下觀察股骨頭內骨小梁、骨細胞形態(tài)及壞死情況，并計算骨細胞空陷窩百分率。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 SANFH兔模型構建

為了后續(xù)實驗的開展，采用激素聯(lián)合脂多糖改良技術建立激素性股骨頭壞死兔模型，在建模第1、2周分別選取兔股骨頭，切片后H&E染色觀察發(fā)現(xiàn)：第2周股骨頭軟骨下骨小梁變細、稀疏，不連續(xù)；骨細胞沿骨小梁成串分布，細胞核不均一，形態(tài)變扁，數(shù)目減少，空骨細胞呈空泡狀，散在分布，脂肪細胞增多(圖1)。以上結果符合股骨頭壞死病理學改變，說明早期激素性股骨頭壞死兔模型構建成功。

圖1 SANFH兔模型構建成功[13]Fig.1 SANFH rabbit model has been successfully constructed[13](a) (b) (c) (d) H&E staining after 1 week of modeling; (e) (f) (g) (h) H&E staining after 2 weeks of modeling; (a) (b) (e) (f) Anterolateral area of femoral head (coronal); (c) (d) (g) (h) Posterolateral area of femoral head (coronal) (BT, bone trabecula; O, osteoblast; A, adipocyte)

2.2 GDNF可使骨密度增加

為了觀察GDNF對激素性股骨頭壞死兔骨質密度的影響，在給藥后第5、10、15、20天分別對實驗組、對照組進行雙髖關節(jié)螺旋CT掃描，觀察發(fā)現(xiàn)：兩組股骨頭形態(tài)保持完整，關節(jié)面較光滑，骨皮質厚度相當；與對照組相比，第15、20 天實驗組骨松質呈磨玻璃樣影，骨質密度增高，尤以第20天明顯；對照組股骨頭骨質密度欠均勻，骨質密度減低，以第10天骨質密度最低(圖2)。以上結果表明，GDNF可保持股骨頭形態(tài)完整，增加骨松質密度。

2.3 GDNF可促進骨小梁的形成

為進一步觀察GDNF對激素性股骨頭壞死兔骨內部結構的影響，在給藥后第5、10、15、20 天分別取實驗組、對照組行顯微CT掃描，觀察發(fā)現(xiàn)：實驗組與對照組第5、10天骨小梁分布稀疏，間距增寬，部分斷裂，骨密度較低；實驗組第15、20天骨小梁逐漸豐富、密集，間距變窄，骨皮質厚度增加，骨質密度增高；與對照組比較，實驗組股骨頭內骨小梁數(shù)量更多，骨皮質更厚，骨質密度更高(圖3)。以上結果表明，GDNF可促進股骨頭內部骨小梁的修復，骨皮質的形成。

圖2 GDNF可增加骨密度Fig.2 GDNF increased the bone density of the femoral headBone density of SANFH rabbits detected by CT images at 5, 10, 15 and 20 days post treatment. (arrows, femoral head)

圖3 GDNF可促進骨小梁的形成Fig.3 GDNF promoted trabeculae formationThe trabeculae of SANFH rabbits detected by Micro-CT images at 5, 10, 15 and 20 days post treatment. (arrows, femoral head)

圖4 BMD、TMD和BV/TV值的變化Fig.4 The variation of BMD, TMD and BV/TVBony masses detected by Micro-CT scanning analysis. *P < 0.05 compared with the control group

2.4 GDNF可影響骨相關參數(shù)的改變

為進一步驗證GDNF對激素性股骨頭壞死的影響，分析顯微CT相關參數(shù)顯示：實驗組、對照組的股骨頭BMD、TMD變化趨勢近乎一致，除第10天數(shù)值較低外，基本上呈上升趨勢；隨著觀察時間延長，實驗組BV/TV值逐步增高，而對照組BV/TV值總體趨勢變化不明顯；與對照組比較，實驗組在第15、20天BMD、TMD、BV/TV值均明顯高于對照組(P<0.05)(圖4)。以上結果表明，GDNF可增高股骨頭內部骨質密度，保持骨小梁完整性。

2.5 GDNF可抑制骨細胞的病理學檢測結果

病理學研究GDNF對激素性股骨頭壞死的影響。在給藥后第5、10、15、20 天分別取實驗組、對照組行兔股骨頭切片、H&E染色，觀察發(fā)現(xiàn)：實驗組股骨頭內骨小梁分布較稀疏，骨細胞分布廣泛，隨觀察時間延長，骨細胞核著色增多，脂肪細胞分布減少；對照組骨小梁形態(tài)不完整，部分斷裂，分布稀疏，隨時間延長，骨細胞空陷窩和脂肪細胞逐漸增多，骨細胞和造血細胞逐漸減少；兩組比較，實驗組第15、20天骨細胞空陷窩百分率顯著低于對照組(P<0.05)(圖5、表1)。以上結果表明，GDNF可通過抑制骨細胞壞死，保持骨小梁完整，對早期激素性股骨頭壞死有潛在的保護作用。

圖5 GDNF抑制骨細胞壞死(×100)Fig.5 GDNF inhibits bone cell necrosis (×100)Histologic results of femoral head detected by H&E staining (×100). (OT, osseous tissue; AT, adipose tissue)

組別5 d10 d15 d20 d實驗組26.3±7.925.3±3.513.3±3.2*10.6±2.4*對照組29.7±7.426.0±2.871.0±7.578.6±5.3

與對照組比較，實驗組第15，20天股骨頭骨細胞空陷窩率有統(tǒng)計學意義(*P<0.05)

Compared with the control group, the percentage of empty bone lacunae of femoral head in the experimental group was significantly lower at 15 and 20 days.(*P<0.05)

3 討論

糖皮質激素導致的股骨頭壞死是非創(chuàng)傷性股骨頭缺血壞死最重要的發(fā)病機制之一，長期或短期過量使用糖皮質激素常作為獨立的高危因素[16,17]，它可導致股骨頭局部血運障礙，引起骨細胞缺血、缺氧和壞死，進一步發(fā)生骨小梁斷裂及股骨頭塌陷。在股骨頭壞死發(fā)展過程中，股骨頭變形塌陷，藥物治療效果很難令人滿意，髖關節(jié)成形手術治療成了必然選擇[18]。因此，在股骨頭壞死早期針對性的有效干預，誘導骨再生，保護骨細胞，有望成為防治股骨頭缺血壞死的有效治療手段[19]。據(jù)此，本實驗通過建立激素性股骨頭壞死動物模型，探索GDNF對兔早期激素性股骨頭壞死的影響。

GDNF屬于TGF-β超家族成員，可被神經末梢攝取，逆向運輸致胞體，在神經系統(tǒng)的發(fā)育、生長、損傷和修復中都具有重要的神經營養(yǎng)作用[10,20]。研究報道，GDNF在中樞神經系統(tǒng)可特異性作用于多巴胺能神經元，在腦缺血、缺氧中對神經元進行保護。因此，GDNF在中樞神經系統(tǒng)多巴胺能神經元損傷所致的帕金森病研究較多[9,21]。另有學者提出GDNF對周圍神經系統(tǒng)均有營養(yǎng)和保護作用, 可促使神經元再生、減少細胞凋亡及促進存活作用[9,12]。

本實驗結果顯示，GDNF對早期股骨頭壞死具有潛在保護作用。一方面，GDNF可保持股骨頭形態(tài)完整，增大股骨頭骨質密度。在股骨頭CT檢測結果中，兩組股骨頭形態(tài)完整，實驗組股骨頭內松質骨密度較對照組增高。由于螺旋CT分辨率不及顯微CT高，在兔股骨頭內細微結構顯示效果欠佳，我們進一步通過顯微CT檢測，觀察GDNF對激素性股骨頭壞死兔骨內部結構的影響。結果發(fā)現(xiàn)，實驗組股骨頭內骨小梁數(shù)量更多，骨皮質更厚，骨質密度更高，結果表明GDNF可促進股骨頭內部骨小梁的修復，骨皮質的形成，表現(xiàn)為骨礦物質密度的增加。

同時有研究證實，激素性股骨頭壞死可對骨代謝諸多環(huán)節(jié)產生影響，如成骨細胞分化、骨細胞凋亡，以及脂質代謝、鈣代謝、微循環(huán)紊亂。對照組骨小梁分布稀疏，間距增寬，部分斷裂，可能原因是破骨細胞作用增強，骨小梁發(fā)生微細骨折，表現(xiàn)在骨小梁數(shù)目和厚度的減少[22,23]。GDNF可能通過營養(yǎng)骨內神經，抑制破骨細胞作用，增強成骨細胞功能，對股骨頭內骨小梁進行修復、重建，促進了骨質形成。

另一方面，GDNF可抑制骨細胞壞死，保持骨小梁完整。病理學結果進一步證實，對照組股骨頭內骨細胞空陷窩數(shù)均高于實驗組，骨小梁形態(tài)不規(guī)則，斷裂，脂肪細胞變大、增多，造血細胞減少，壞死發(fā)生明顯嚴重，實驗組股骨頭內骨小梁形態(tài)完整，骨細胞分布廣泛，脂肪細胞較少。該結果表明注射GDNF對兔股骨頭缺血壞死早期促進了骨質修復，保持了骨小梁的完整性，阻斷了骨細胞壞死的進一步發(fā)展。本實驗結果顯示，GDNF可能通過營養(yǎng)股骨頭內損傷的神經，進而增強成骨細胞功能，調節(jié)骨內微循環(huán)平衡，從而促進骨質修復，調節(jié)骨的形成，保持骨小梁完整，是否對早期股骨頭壞死具有潛在的保護作用還需要進一步研究。

雖然本研究取得了一定成果，但仍存在諸多缺陷。接下來，本研究將繼續(xù)加大樣本量，通過CT、核磁共振、骨活檢等體內實驗以及Western blot、免疫組化、鈣鹽沉積等體外實驗，進一步探討GDNF干預激素性股骨頭壞死早期病程的研究。